口腔白念珠菌病动物模型的研究进展

张立芳 王好公 谷 悦 刘 昆 刘 娜 刘 庆

作者单位：050017 石家庄，河北医科大学口腔医学院·口腔医院，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心

口腔念珠菌病是发生在口腔黏膜的机会性真菌感染，白念珠菌是主要致病菌[1]，人类在饮食、社会习惯及免疫状况等方面的显著差异会影响疾病的病因学和发病机制[2]，因此需要合适动物模型来研究宿主－病原体的相互作用及开发新的抗真菌药物或替代疗法。早期研究者曾用猴子诱导义齿性口炎，在生物学上猴子虽然是最接近人类的生物，然而，它们维持昂贵，难以操纵；兔子和豚鼠进行口腔操作也相对具有挑战性；仓鼠颊囊并不是非常类似于人类的口腔黏膜，这使得它们不太适合作为实验对象[3]。大鼠和小鼠在进化上与人类较接近，而且可以通过特定的接种途径进行精确接种[4]，许多研究者利用这两种动物开发的口腔念珠菌模型都真实模拟了人类口腔念珠菌感染，已成为研究黏膜白念珠菌感染的标准工具[5]。

口腔念珠菌病临床类型主要包括假膜性念珠菌病（鹅口疮）、红斑性念珠菌病（义齿性口炎）以及增殖性念珠菌病[6]。本文主要就鹅口疮和义齿性口炎的小鼠和大鼠模型及其实用性进行综述。

一、鹅口疮模型

鹅口疮是由白念珠菌引起的以白色凝乳状物为特征的口腔黏膜病，常见于长期使用广谱抗生素、口干症和免疫力低下患者[5，7]。

1.小鼠

（1）造模方法：早期曾有研究者[6～9]通过切除涎腺、使用雌激素或辐射方法诱导小鼠口腔念珠菌感染，由于缺乏典型鹅口疮病损和定量评价，这些动物模型仍有局限性，应用较少，现如今大多数研究者都是在免疫抑制小鼠中进行。

Takakura 等[10]较早利用免疫抑制剂模拟人类口腔自然感染，该模型在感染前1 天和感染后第3 天皮下注射免疫抑制剂泼尼松龙（100mg/kg），感染前1 天在小鼠饮水中加入浓度为0.83mg/ml 的盐酸四环素直至实验结束，并以用蘸有白念珠菌悬浊液（TITT2640，2.5×107个 /ml）的棉签擦拭颊、舌、软腭等口腔黏膜的接种方式产生感染。然而，李成蹊等[11]将注射免疫抑制剂的方式改为肌肉注射，建立的模型比Takakura 等较早出现明显伪膜和较高的菌量，因此作者推测肌注法免疫抑制作用更强。有学者[12，13]认为少量念珠菌可通过繁殖到较高数量诱导感染，念珠菌浓度不重要，因此推测菌种SC5314 致病性强于TITT2640。

口咽念珠菌病多见于免疫力低下患者，在艾滋病毒感染过程中，高达80%的患者会出现这种疾病[14]。诱导口咽念珠菌病方法[15～17]是小鼠分别于接种前1 天，接种后1、3 天皮下注射醋酸可的松进行免疫抑制，将浸有白念珠菌悬浮液的棉球置于口腔或舌下75min～2h，诱导长时间感染，有学者[5]认为该模型是研究口咽念珠菌病的标准动物模型。也有研究者[18]等将此模型和体内成像技术结合，接种基因工程生物荧光白念珠菌，开发可实时监测口咽念珠菌病发展的模型，与传统舌组织菌落形成单位（colony-forming units，CFU）测定相比，通过测量光子发射所检测真菌负荷更能快速且准确反映整个口腔真实真菌负荷，这个模型还可以识别白念珠菌在特定器官的靶部位，可以作为一种新的方式探索白念珠菌从局部向系统传播机制。

（2）模型评估：一般从口腔病损、真菌载量、组织病理学方面进行评估。

口腔病损评价：成模后口腔病损一般表现为伪膜或白斑。研究者[10，13]对小鼠舌背表面伪膜或白斑面积及厚薄评分标准如下：0 分：正常；1 分：少量薄伪膜或白斑，覆盖舌表面＜20%；2 分：薄伪膜或中量白斑，覆盖舌表面积≤90%且＞21%；3 分：薄伪膜或大量白斑，覆盖舌表面积＞91%；4 分：厚伪膜或大量白斑，覆盖舌表面积＞91%，口腔黏糊，流涎明显。研究者对成模持续时间研究发现泼尼松龙模型至少持续 7 天[10，11]，若发生系统感染死亡率增加，模型持续时间缩短[13]。口咽念珠菌模型至少持续9 天[15]。

真菌载量测定：感染后小鼠舌部菌量一般呈递增－平稳－下降趋势，泼尼松龙模型[10，11]稳定期一般为感染后3～5 天，菌量维持在105～106CFU，若黏膜感染蔓延至系统感染，舌部菌量从感染后第3天开始递减[13]。口咽念珠菌醋酸可的松模型[15]稳定期为感染后5～9 天，菌量维持在105～106CFU。

组织病理学：鹅口疮模型组织学可观察到大量菌丝覆盖于舌背上皮，并已侵入上皮组织，上皮层结构被破坏，同时伴有炎性浸润。另外，口咽念珠菌模型PAS 染色显示白念珠菌细胞已侵入食道黏膜的浅表上皮层[10，11，13，15]。

（3）模型应用：抗真菌药物或抗真菌光动力疗法疗效评价：小鼠免疫抑制剂-念珠菌感染模型相对来说既有稳定感染期，又有典型鹅口疮局部症状，许多研究者借鉴此种模型评价抗真菌药物或抗真菌光动力疗法的疗效。Jiang 等[19]利用Takakura 等开发的模型评估氟西汀联合卡泊芬净对口腔念珠菌病的抗真菌活性；Carmello 等[20]也通过此模型检测阳离子纳米乳包封氯酞菁铝（CLALP-NE）介导的光动力疗法在体内治疗口腔念珠菌病的效果。另外，也有学者[21，22]利用口咽念珠菌模型证明唾液中天然存在的趋化因子CCL28、组蛋白-5 生物黏附性水凝胶等是治疗口咽念珠菌病的候选药物。

毒力因子和易感因素研究：Nobile 等[23]构建口咽念珠菌模型时发现缺乏转录因子Rim101 白念珠菌对黏膜上皮细胞损伤较野生型小，说明Rim101是白念珠菌重要毒力因子；此外，Bichele 等[24]也通过该模型发现缺失免疫细胞因子IL-22 的小鼠真菌清除率降低，证实IL-22 缺失在导致宿主对念珠菌感染易感性方面发挥重要作用。

口腔微生物学研究：有学者[25]将口咽念珠菌模型用于研究白念珠菌生物膜结构，发现共生菌参与生物膜组成，提示口腔共生菌群在白念珠菌感染中发挥重要作用。之后，研究人员[26～29]还构建白念珠菌和链球菌联合感染模型，发现链球菌可以通过增强感染的炎症反应来增加白念珠菌毒力。kong 等[30]也用相同的方法探究在口腔念珠菌病的发展过程中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的相互作用关系。

2.大鼠

（1）造模方法：在20 世纪50 年代后期，与使用四环素等广谱抗生素相关浅表感染的报告数量逐步增加，70 年代初，许多研究者[2]大多以喂食四环素的方法诱导大鼠口腔感染，建模所需时间长，病变主要表现为局限性乳头萎缩，虽没有鹅口疮典型症状，近些年来也有学者应用此模型研究口腔念珠菌病病因学及治疗策略[31]。然而，吕秋菊团队[32]将大鼠饮水中四环素改为青霉素，并在右颊黏膜接种白念珠菌后，在不划破黏膜情况下每周用无菌探针轻划黏膜3次成功诱导建模。此外，免疫抑制剂地塞米松联合四环素的大鼠实验性口腔念珠菌感染模型[33]也已开发，实验大鼠从接种第1 天一直到实验结束，饮食含0.5mg/L 免疫抑制剂地塞米松饮用水和0.1%盐酸四环素水溶液。每隔48 小时，大鼠口服含白念珠菌的生理盐水悬浮液0.1ml，一共接种3 次。

（2）模型评估：一般从口腔病损、真菌载量、组织病理学方面进行评估，与小鼠鹅口疮模型相似。

（3）模型应用：上述两种模型建模成功后，可用于抗真菌药物疗效评估。Chami 等[34]利用地塞米松联合四环素的模型比较了植物源物质（香芹酚和丁香酚）和制霉菌素对口腔念珠菌病的影响。

白念珠菌是大鼠口腔中一种低水平的共生体，当需要考虑先天免疫反应对疾病过程的影响时，在人工接种之前，需要排除念珠菌的自然口腔定植。与大鼠不同，白念珠菌不是常规实验小鼠口腔内的常驻微生物，此外，健康小鼠口腔黏膜的免疫生物学特征也被许多学者很好地描述，使其成为阐明黏膜组织对念珠菌感染的适应性免疫反应的理想材料，并且小鼠相对成本低，相对容易管理，因此免疫抑制剂联合四环素的小鼠鹅口疮模型更加广泛应用[6]。

二、义齿性口炎模型

义齿性口炎是一种由粘附或定植在义齿材料上的念珠菌引起腭部黏膜以红斑为主要特征的黏膜炎症，病原体主要以白色念珠菌为主。表现为口腔疼痛，影响进食和说话，彻底清除义齿材料上的真菌是治疗成功的关键[5，35]。

1.造模方法：早期的义齿性口炎体内模型将丙烯酸假牙安装在猴子口腔腭部模拟人类假牙口炎的组织病理学，然而，由于伦理和成本问题阻碍这种模型的广泛使用。大鼠尺寸相对较小，但口腔较大，可以容纳假牙放置，而且成本较低、容易饲养，因此大鼠模型已成为研究义齿性口炎的金标准[5]。

Nett 等[36]利用正畸金属丝将非定制义齿固定于经可的松免疫抑制的大鼠口腔两侧磨牙之间腭黏膜处，不过，可能由于非定制义齿与上腭无法贴合，腭部黏膜没有出现炎症。Tobouti 等[37]对上述模型加以修改成功构建模型，主要不同在于：一是通过在大鼠口腔取印膜为每只大鼠定制独立丙烯酸义齿基托实现假牙与上腭最佳接触；二是诱导念珠菌感染时未使用免疫抑制剂，因为目前没有科学证据表明义齿性口炎与免疫力有关；三是将义齿放入含菌悬浮液（107个/ml）中孵育90min，以获得高通量定植。然而Sultan 等[38]对免疫抑制剂的使用持有不同意见，作者认为若不使用免疫抑制剂，为了确保白念珠菌定植成功需接种高通量念珠菌，这不能反映人类口腔的正常情况。同时作者把义齿固定方式改为复合材料粘接固定，与正畸丝固定法相比，这样可以更好保持装置并达到紧密贴合的目的。此外，作者还开发了一种三维打印数字化设计的大鼠口腔内装置，该装置仅对一只大鼠进行一次印模，对生成的模具进行光学扫描从而创造一个数字模型，进而对模型进行数字化调整，为大鼠制作一种通用匹配的口腔内装置，节约成本，省时省力，这种通过正常浓度菌液（108或109个/ml）建立的模型在相同时间出现的症状比Tobouti 的模型严重。Johnson 等[39]利用个体印膜铸造技术在免疫活性大鼠口腔中开发了一种新型由固定和可拆卸部分组成的定制义齿系统模型，固定部分嵌有磁铁，通过正畸丝固定在后磨牙上，安装在前腭的可拆卸部分通过嵌入的金属棒磁性地连接到固定部分，可拆卸部分更容易更换和重复取样，允许进行纵向分析。

2.模型评估：一般从口腔病损、真菌载量、组织病理学方面进行评估与鉴定。

（1）口腔病损评价：成模后口腔病损轻者表现为点状红斑，重者表现为弥漫性红斑或水肿。有学者对大鼠腭部组织病损和炎症程度进行评分：0：无炎症；1：点状红斑；2：弥漫性红斑和水肿；3：弥漫性红斑/水肿和乳头状增生[39]。

Tobouti 等高浓度感染模型和Sultan 等免疫抑制剂模型在感染后第4 天出现症状，属于急性义齿性口炎模型。Johnson 等开发的新型啮齿动物义齿系统由于未使用免疫制制剂，感染后第4 周出现症状，属于慢性义齿性口炎模型[37～39]。

（2）真菌载量测定：真菌载量一般随时间递增，慢性义齿性口炎模型菌量一般在2～8 周内维持较高水平[39]。

（3）组织病理学：腭黏膜组织病理学特征一般表现为腭皱襞过度角化，伴有微脓肿，组织被菌丝侵袭[37～39]。

3.模型应用：研究者除了利用模型研究义齿性口炎相关治疗[38]外，还可以通过模拟义齿生物膜形成来测试特定基因对生物膜影响[40]。

近年来，有关白念珠菌和链球菌、金黄色葡萄球菌等口腔共生菌联合感染模型亦见诸多报道[41，42]，因此，与白念珠菌单一模型相比，混合感染模型更接近于疾病的真实状态，混合感染造成病理生理改变及相应的有效治疗方法或许是未来的一个研究方向。