综合评价ELISA法诊断口腔天疱疮的应用价值

程 喆 文 静 韩 莹 金建秋 李斌斌 宋江园 徐 偲 刘晓丹 崔红梅 赵忠芳 王 倩 郭 骧 鲁明星 刘宏伟

天疱疮是一种自身免疫性大疱类疾病，中老年人好发，亚洲地区的黄色人种也是好发人群[1，2]。寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是口腔黏膜最常见的一型。

PV 被认为是一种自身免疫病，患者循环血中出现针对自身棘层细胞表面桥粒的特异性抗体，这些特异性抗体靶抗原是桥粒芯蛋白3（desmoglein-3，Dsg3）和桥粒芯蛋白 1（desmoglein-1，Dsg1）。这两种桥粒芯蛋白一旦遭到攻击，上皮细胞间紧密连接被破坏，就会导致“棘层松解”，形成“上皮内疱”[2～4]。

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测抗 Dsg3、Dsg1 抗体是近年来在我国逐渐采用的诊断方法之一，它可以定性和定量地判断病情的轻重、指导临床治疗的激素用量[5，6]。本研究将采用多种实验诊断学指标分析ELISA 法在诊断口腔天疱疮中的价值。

资料和方法

1.研究对象

选择2010.1.1～2019.12.31 期间就诊于北京大学口腔医院口腔黏膜科的患者，符合以下纳入排除标准。

（1）纳入标准：①实验组：经临床和病理诊断为天疱疮的患者；②对照组：经临床和病理诊断为类天疱疮的患者；③年龄为18～85 岁；④未经任何治疗；⑤无合并的其他口腔黏膜病；⑥进行了ELISA 检查Dsg3 和Dsg1；⑦无其他免疫系统疾病和严重全身疾患；⑧无精神障碍；⑨同意进入本研究。

（2）排除标准：①年龄小于18 岁或大于85 岁；②处于妊娠期或哺乳期的女性；③过敏体质者；④病损区域曾经激光、放射或化学药物治疗；⑤有其他恶性肿瘤等严重全身疾患；⑥有精神障碍；⑦其他原因致不能配合检查。

2.诊断金标准

天疱疮和类天疱疮的诊断参照《口腔黏膜病学》和《口腔组织学与病理学》的诊断标准[2，19]。以组织病理学诊断作为金标准。

3.ELISA 检测方法及结果的判读

患者于医院检验科行血清抗Dsg1 和Dsg3 抗体的检测。

结果判读：抗Dsg1 抗体水平：≥20U/ml 为阳性，14～20U/ml 为不确定，＜14U/ml 为阴性。抗 Dsg3抗体水平：≥20U/ml 为阳性，7～20U/ml 为不确定，＜7U/ml 为阴性。抗Dsg1 或Dsg3 抗体任一结果为阳性时，则记ELISA 结果为“阳性”；其余情况则记为阴性。

4.统计学分析

患者的信息进行双人平行录入，再加第三人核对，无误后使用 IBM SPSS 17.0 软件（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计学分析。计数资料的检验采用卡方检验，计量资料采用独立样本t检验。计算ELISA 法检出抗Dsg1 或Dsg3 抗体的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数，并绘制ROC 曲线。

Logistics 回归分析的方法选择向后：条件，协变量的进入概率为0.05，删除概率为0.10。本研究所有P值均为双侧检验，统计学差异显著性水平设置为P＜0.05。

结 果

研究对象包括140 例实验组的PV 患者以及157 例对照组的类天疱疮患者（表1）。实验组患者中男性44 例，女性96 例，就诊时年龄分布为20～82岁，平均 50.42±12.76 岁；对照组中男性 53 例，女性125 例，就诊年龄分布为26～85 岁，平均59.71±11.81岁。两组患者间性别差异不具有统计学意义（P＞0.05），而年龄差异具有统计学意义（P＜0.05）。

纳入的2 组患者均具有口腔黏膜损害。实验组140 例PV 患者中139 例出现鲜红糜烂面，占99.3%；111 例出现周缘扩展或尼氏征，占79.3%；109 例出现口腔黏膜云雾状水肿，占77.9%；20 例出现水疱病损，占14.3%；33 例患者具有皮肤病损，占23.4%。对照组157 类天疱疮患者中，127 例出现糜烂面，占80.9%，显著低于实验组，P＜0.05，且糜烂面上覆黄色伪膜，而非鲜红糜烂面；57 例出现水疱病损，占36.3%，显著高于实验组，P＜0.05；出现周缘扩展或尼氏征52 例，占33.1%，显著低于实验组，P＜0.05；类天疱疮的口腔黏膜云雾状水肿（1.9%）及皮损（3.8%）很少见，显著低于实验组，P＜0.05；（表 1）。

表1 两组患者的临床表现及比率

141 例 PV 患者中，69 例抗 Dsg1 抗体阳性，129例抗 Dsg3 抗体阳性，131；对照组中，7 例抗 Dsg1 抗体阳性，5 例抗Dsg3 抗体阳性。卡方检验两组有显著差异，P＜0.05（表 2）。

表2 ELISA 法检出抗Dsg1 和抗Dsg3 抗体阳性

ELISA 法诊断口腔天疱疮价值的诊断指标：敏感度为 93.6%（131/140），特异度为 93.3%（147/157），准确度为93.6%（279/297），阳性预测值为92.9%（131/141），阴性预测值为 94.2%（147/156），约登指数为87.2%（93.6%+93.6%-1）。见表3。

表3 评估ELISA 法诊断价值的指标

ROC 曲线见图1，结果显示抗Dsg3 抗体的ROC 曲线在坐标系中最靠近左上角，具有最大的曲线下面积（0.942），诊断能力最强，ELISA 结果和云雾状水肿紧随其后。

图1 8 种方法诊断天疱疮的ROC 曲线

抗Dsg3 抗体、ELISA 结果和云雾状水肿的ROC 曲线在坐标系中靠近左上角，诊断能力很强。

8 种临床或实验室指标的P 值均小于0.05，说明本研究选取的8 个诊断试验指标均对于诊断天疱疮有统计学意义。按照ROC 曲线下面积从大到小排列的指标顺序是：抗Dsg3 抗体阳性、ELISA（抗Dsg1或Dsg3 抗体阳性、云雾状水肿、周缘扩展或尼氏征、抗Dsg1 抗体阳性、皮损、鲜红糜烂面和水疱。抗Dsg3 抗体阳性、ELISA 结果和云雾状水肿的ROC曲线同样很靠近左上角，是正向预测里面积＞0.85的、效果很好的诊断实验指标；周缘扩展或尼氏征、抗Dsg1 抗体阳性、皮损和鲜红糜烂面的ROC 曲线下面积是大于0.5 的正向预测值，但在0.5～0.7 之间的诊断效果欠佳。水疱的ROC 曲线下面积是小于0.5 的是反向预测值，诊断不准确，见表4。

表4 ROC 曲线下的面积

以是否诊断为天疱疮为因变量，以性别、年龄、有无皮损、有无鲜红糜烂面、有无云雾状水肿、有无水疱、有无周缘扩展或尼氏征、Dsg1 结果、Dsg3 结果和Dsg1 结果、Dsg1 或Dsg3 结果作为协变量，进行Logistics 回归分析。揭示：抗Dsg3 抗体阳性（OR＝23.332，P＝0.000）、云雾状水肿（OR＝19.725，P＝0.000）、周缘扩展或尼氏征（OR＝4.822，P＝0.027）、年龄（OR＝6.106，P＝0.013）是诊断为天疱疮的风险因素。而性别、皮损、鲜红糜烂面、有无水疱、抗Dsg1抗体阳性和ELISA 结果患天疱疮无显著性相关（表5）。

表5 天疱疮的Logistics 回归分析

讨 论

PV 是一种严重的慢性自身免疫性大疱性疾病，可以导致全身皮肤或者黏膜反复起疱、破溃、糜烂、渗出，其中口腔黏膜是起最常见的初发区域，甚至有的患者仅有口腔黏膜病损。本研究中PV 患者全部具有口腔病损，只有约四分之一的患者具有皮肤病损。

PV 预后较差，给患者的生活带来极大地不适，如病情不加控制，甚至能引起电解质紊乱、严重感染、恶病质，最终危及生命[2]。因此疑似PV 的患者应该引起临床大夫的重视，做到早发现、早诊断、早治疗，以减轻患者的痛苦，避免病情加重，同时也可以从某种程度上控制糖皮质激素的用量，预防其副作用的发生。

对本研究选取一些天疱疮临床特征性指标，如鲜红糜烂面、水疱、周缘扩展或尼氏征，其判断是具有主观性的，是需经过训练的口腔黏膜病专科医生才能识别的。因为天疱疮发生的是上皮内疱，疱壁很薄，水疱难以长期存留在口腔而不易多见，这是水疱比率低的原因；疱破后露出的鲜红糜烂面就较水疱更多见，因此鲜红糜烂面的发生比率高于水疱；周缘扩展或尼氏征需检查者掌握技巧和具有检查意识，检出率也因此不高；云雾状水肿虽检出比率高，但是常不易与口腔黏膜白色病损鉴别，特异性差；就诊于口腔黏膜科的天疱疮患者皮损比率本身就很低；相比之下，用ELISA 法检出抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗体就很客观，且阳性率远高于上述天疱疮临床指标，是口腔黏膜病专科医师和口腔全科医师都可依据的诊断指标。

天疱疮的诊断往往需要多种方法共同验证，其检查方法随时代发展日益成熟进步，时至今日，天疱疮的常用检查方法包括：临床检查、组织病理学检查、脱落细胞学检查、直接免疫荧光、间接免疫荧光和ELSIA[6～10]。其中ELISA 是最新提出的检测手段，一经应用便因其少创广受欢迎，早在上世纪90 年代就有学者认为ELISA 的敏感度和特异性均很高[11]，是诊断天疱疮的可靠检查手段。但在最近10 年，ELISA 才在我国得到广泛的认同和开展。

抗Dsg3、抗Dsg1 抗体这两种桥粒芯蛋白均隶属于桥粒钙黏素家族，可以起到黏附、连接、支持的作用，具有连接相邻上皮细胞，维持正常细胞和组织形态的功能。一旦Dsg1、Dsg3 遭到攻击，钙黏素复合体的构象和稳定性均受影响，桥粒的形成受抑，上皮细胞间的紧密连接被破坏，就会导致“棘层松解”，形成“上皮内疱”[2～4]。因此，抗 Dsg3、抗 Dsg1 抗体既反映天疱疮的发病机制，也与临床疱损紧密关联。

根据长期文献报道，ELISA 诊断天疱疮的敏感度为 80%～100%[12～17]，特异性可达 90%以上[12，16，17]。在我们的研究中，ELISA 的敏感度和特异性分别为93.6%和93.3%，与既往的研究一致。其准确度也具有较高的水平，是可靠的诊断工具。

ELISA 在具有高度敏感度和特异性的同时，还可以区分PV 的不同表型，这是由于Dsg1 和Dsg3在人体不同部位具有相异的表达和分布：在口腔黏膜和食管，Dsg3 在上皮全层均有表达，Dsg1 在基底部表达较多而在全层较少；而在表皮内，Dsg3 在基底部的角质形成细胞高表达，Dsg1 在表皮全层表达，特别是表皮的上部表达更高。血清中存在的抗Dsg1 和抗Dsg3 的自身抗体的量不同也就导致了PV 患者在表皮中形成水疱的位置的多样性，最终可以将其区分为黏膜主导型和皮肤黏膜型[6]。黏膜主导型PV 患者血清中仅有抗Dsg3，由于Dsg1 可补偿抗Dsg3 抗体在皮肤造成的损伤，故皮肤损害较轻，或没有损害；但无法弥补抗Dsg3 抗体在黏膜处造成的对Dsg3 的破坏，故黏膜损害较重。皮肤黏膜型PV患者的血清中同时存在抗Dsg1 和抗Dsg3 抗体，因此出现皮肤和黏膜损伤[18]。

这种Dsg1 和Dsg3 的表达和分布差异，也可以解释多因素回归分析的结果：选取的研究对象以黏膜损害为主，少有出现皮损，理论上外周血中抗Dsg1 抗体的水平较低，因而研究中实验组和对照组只在抗Dsg3 抗体阳性上的差异具有统计学意义，而在抗Dsg1 抗体阳性上的差异不具有统计学意义；受抗Dsg1 抗体阳性的影响，ELISA 整体结果的差异也不具有统计学意义。这也提示，对于临床疑似口腔天疱疮的患者，其ELISA 结果中抗Dsg3 抗体的结果对于确诊更有意义。

ROC 曲线或称为受试者工作特征曲线，可用来表达灵敏度与特异度的关系。通常选用ROC 曲线下的面积大小作为评价诊断试验绩效的指标，最完美和理想的诊断试验的ROC 曲线下的面积大小应该等于或接近1。ROC 曲线越向左上偏，曲线下的面积越大，其诊断试验识别患者和非患者的能力越高。我们的研究中选取了临床表现及ELISA 检测中的8个指标作为诊断试验指标，分别绘制了ROC 曲线进行比较，最终发现“抗Dsg3 抗体阳性”的ROC 曲线在坐标系中最靠近左上角，具有最大的曲线下面积（0.942），说明在上述8 种指标中，抗Dsg3 抗体阳性在诊断口腔天疱疮时具有最高的应用价值。ELISA 结果（Dsg3+Dsg1）和云雾状水肿2 个指标同样具有较高的曲线下面积（均＞0.85），分别为0.936和0.881，对于诊断口腔天疱疮亦具有较高的价值。

天疱疮的Logistics 回归分析中，最后留在方程中的变量有5 个：抗Dsg3 抗体阳性、云雾状水肿、周缘扩展或尼氏征、年龄和水疱，前4 个因素与天疱疮的诊断显著相关。抗Dsg3 抗体阳性的概率是对照组患者的23.332 倍；天疱疮患者出现云雾状水肿的比率是对照组患者的19.725 倍；天疱疮患者出现周缘扩展或尼氏征的可能性是对照组患者的4.822倍；天疱疮患者比对照组患者早发病10 年的可能性是对照组患者的6.106 倍。

本研究中发现ELSIA 的敏感度为93.6%，特异性为93.6%，准确度为93.6%，阳性预测值为92.9%，阴性预测值为94.2%，约登指数为87.2%。实验组和对照组在“抗Dsg3 抗体结果抗体阳性”、“云雾状水肿”和“年龄”因素上具有显著差异。结合Logistics 回归分析和ROC 曲线下面积分析，综合评估结果显示ELSIA 法有很强的诊断能力，对天疱疮的诊断具有很好应用价值。

除此以外，相比于组织病理学、直接免疫荧光和间接免疫荧光，ELISA 还具有操作简便、微创、对设备要求较低的优势，同时，由于ELISA 的结果为定量结果，治疗中可多次检测进行对比，分析患者身体中自身抗体滴度以实现指导用药，起到精准治疗的目的。

综合上述多因素分析和ROC 曲线的结果，我们不难发现，通过ELISA 法检测外周血中自身抗体，特别是抗Dsg3 抗体来诊断口腔天疱疮，方法简便，微痛无创，具有较高的敏感度和特异性，对于口腔天疱疮的诊断具有重要意义。