罗望子种仁球蛋白结构和功能特性的构效关系

任丽琨，安 琪，边 鑫，陈凤莲，杨 杨，王 冰，艾连中，宋子波，向艳玲，石彦国，张 娜*

（1 哈尔滨商业大学食品工程学院 黑龙江省食品科学与工程重点实验室 哈尔滨150076 2 上海理工大学医疗器械与食品学院 上海200093 3 云南猫哆哩集团食品有限责任公司 云南玉溪653100）

罗望子（Tamarindus indicaL.），又名酸角，属豆科，是一种高大常绿乔木，多见于我国西南省份且多呈半野生状态[1]。罗望子的营养价值丰富，其种皮富含单宁、色素；果肉富含多糖、有机酸等营养成分；种仁则以蛋白质、多糖及脂肪等为主要成分，其中多糖约占种仁的60%，常作为增稠剂和稳定剂应用在食品、饮料及烟草工业上，而对于提取多糖后残渣的综合利用研究甚少[2]。探究罗望子种仁多糖提取后残渣的营养成分并对其进行综合利用，从而实现种仁产业链的延长刻不容缓。

Reddy 等[3]研究表明提取多糖后的罗望子种仁残渣中仍含有丰富的蛋白质，在印度、苏丹等酸角主产国常被开发成饲料。我国虽然盛产罗望子，然而对其科学研究起步较晚且由于提取种仁多糖后的残渣部分含有黏稠性的不易加工的残余多糖，因而在工业上常当作废料处理，这不仅污染环境，而且资源大量浪费。蛋白质的结构与功能息息相关，其氨基酸构成、分子质量的大小、形态和空间结构等因素对蛋白质的功能和理化性质均有较大的影响，如蛋白质的肽键及氨基酸侧链能够显著影响其溶解性，而其乳化性质受到自身分子大小及表面亲疏水性等因素的影响[4]。自上世纪70年代以来，众多学者相继测定了罗望子种仁的营养成分[5-7]，发现罗望子种仁中蛋白含量高达19.4%，且以种仁球蛋白（Tamarind seed globulin，TSG）和白蛋白为主，TSG 中含有18 种氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸含量较高。此外，TSG 的氨基酸种类齐全，评分较高，必需氨基酸指数为71.5，除苏氨酸和酪氨酸外其它6 种必需氨基酸俱全，尤以赖氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸最为丰富。上述研究证实罗望子种仁蛋白是一种优质植物蛋白资源，具有较强的开发价值。目前对于罗望子种仁蛋白质结构、功能特性及其构效关系尚未见研究报道。本文以罗望子种仁提取多糖后的残渣为原料，提取罗望子种仁球蛋白，通过电泳、巯基二硫键含量及氨基酸组成等分析指标对其蛋白结构进行分析，并测定其溶解性、乳化性及乳化稳定性，研究其构效关系，为日后TSG 的功能注释及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗望子种仁提取多糖后残渣，来自云南猫哆哩集团食品有限责任公司；大豆分离蛋白，购于山松生物制品有限公司；九三非转基因一级大豆油，购于九三粮油工业集团有限公司。

柠檬酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯），购于哈尔滨市化工试剂厂；SDS、TEMED、丙烯酰胺、甲醇、冰醋酸、亚甲基双丙烯酰胺（均为分析纯），购于天津市志远化学试剂有限公司；葡聚糖凝胶SephadexG-50，购于Summus 公司；考马斯亮蓝R-250（分析纯），购于天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

FW-135 粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；TDL-4A 离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；722 紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DYY-7C 垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；Thermo UltiMate3000 高效液相色谱仪，上海硅仪生化科技有限公司；FJ300 高速均质乳化机，上海沪析实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 罗望子种仁蛋白的提取 罗望子种仁提取多糖后的残渣中残留多糖含量为（0.86±0.45）%，采用超声辅助碱溶酸沉法从残渣中提取TSG，将去除多糖的沉淀与pH 7.4 的Tris-HCl 缓冲液混合配置为质量浓度为25 g/L 的溶液，调节溶液pH值为12.5，使用恒温磁力搅拌器于65 ℃下搅拌1.5 h 后放入250 W 超声清洗器内超声1 h，超声后的溶液在4 000 r/min 的条件下离心15 min，上清液备用，沉淀重复上述步骤。合并上清液，调节pH 值为TSG 的等电点4.6 静置30 min 后，于8 000 r/min 离心10 min，所得沉淀即为粗TSG。再通过Osborn 法将提取过TSG 的沉淀与去离子水混合（33.3 g/L），使用恒温磁力搅拌器室温搅拌1 h，于8 000 r/min 离心15 min，所得上清液即为清蛋白，保留沉淀继续提取盐溶蛋白，醇溶蛋白和谷蛋白，提取操作同上，但所用溶剂不同，依次为5%的NaCl 溶液、70%乙醇和0.25%的NaOH 溶液。本试验主要对含量最高的，具有良好物化性质的TSG 进行研究，因此将提取的粗TSG 溶于去离子水调节至中性pH 7.0 再通过葡聚糖凝胶柱层析法纯化，获得高纯度TSG，冷冻干燥用于后续试验。

1.3.2 SDS-PAGE 测定分子质量 根据Laemmli等[9]的方法，采用SDS-PAGE 凝胶电泳测定制备的TSG 分子质量。配制12%分离胶，5%浓缩胶，采用垂直电泳装置电泳，考马斯亮蓝染色，通过凝胶呈像系统扫描，Quantity One 软件分析。

1.3.3 巯基（SH）和二硫键（S-S）含量的测定 根据Wen 等[10]的方法稍加修改，对游离巯基含量进行测定，0.5 mL 1 mg/mL TSG 溶液加入2.5 mL Tris-Gly 缓冲液（含8 mol/L 尿素，pH 8.0）和0.02 mL 4 mg/mL DTNB 快速混合，将其置于25.0 ℃水浴30 min 后用分光光度计测定在412 nm 处的吸光度值，使用公式（1）计算游离SH 含量。

式中：A412——412 nm 处吸光值；D——蛋白样品稀释倍数；C——样品蛋白质质量浓度，mg/mL。

参考Wen 等[10]的方法并适当修改，对二硫键含量进行测定，0.5 mL 1 mg/mL TSG 溶液加入5 mL Tris-Gly 缓冲液（含10 mol/L 尿素，pH 8.0）和0.1 mL β-巯基乙醇，于25.0 ℃混合反应1 h，加入30 mL TCA（质量浓度120 g/L）沉淀大分子蛋白并于10 000 r/min 离心10 min，重复3 次，收集沉淀物溶于15 mL Tris-Gly 缓冲液（含8 mol/L 尿素，pH 8.0）中，加入0.15 mL DTNB（4 mg/mL）快速混合，将其置于25.0 ℃水浴30 min，使用紫外分光光度计在412 nm 处测定吸光度值，进行S-S 含量的计算，公式如（2）所示。

式中：C′SH——总巯基含量，μmol/g；CSH——游离巯基含量，μmol/g。

1.3.4 氨基酸的测定 参照卫阳飞等[11]的方法取0.50 g 蛋白样品加入10 mL 6 mol/L 的盐酸，于110.0 ℃水解24 h，抽滤，经60.0 ℃反复旋转蒸发3 次，定容至10 mL，过0.45 μm 的滤膜，样品备用。

采用PITC 柱前衍生氨基酸分析法对氨基酸含量进行分析，精密量取800 μL 混合氨基酸标准品溶液，置于5 mL 离心管中。加入400 μL 1 mol/L 的三乙胺乙腈溶液，混匀，随后精密加入0.1 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液400 μL，混匀后室温放置1 h，加入2 mL 正己烷，剧烈振摇，静置10 min，取下层溶液过0.22 μm 滤膜注入高效液相色谱仪中进行色谱分析并记录色谱图；另精密量取样品测定溶液400 μL，测定方法同上，参照GB 5009124-2016 对氨基酸含量进行计算[12]。

1.3.5 溶解性的测定 参照Garcia 等[13]的方法对蛋白溶解性进行测定，将TSG 和大豆分离蛋白溶于去离子水中配置成50 mg/mL 溶液，用2 mol/L的HCl 和NaOH 溶液调节溶液pH 值，于室温下搅拌30 min 后以4 000 r/min 离心30 min，取上清液于280 nm 波长下测定紫外分光光度值。

式中：m1——上清液蛋白质含量，g；m2——总蛋白质的含量，g。

1.3.6 乳化性和乳化稳定性的测定 参照Garcia等[13]的方法对蛋白乳化性和乳化稳定性进行测定。将TSG 和大豆分离蛋白溶于去离子水中配置成质量浓度为10 mg/mL 的溶液，使用2 mol/L 的HCl 和NaOH 对其pH 值进行调节，加入等体积大豆油，10 000 r/min 高速剪切2 min，4 000 r/min 离心15 min，测量乳化层体积，液体总体积及30 min 后乳化层体积。并用如下公式计算乳化性和乳化稳定性。

式中：V1——乳化层体积，mL；V2——30 min后乳化层体积，mL；V3——液体总体积，mL。

2 结果与分析

2.1 分子质量

采用SDS-PAGE 电泳法，以蛋白质标准品为对照组，对TSG 的分子质量进行测定，结果如图1所示。图中最左侧条带为蛋白质标准品，条带1 为上样质量浓度8 mg/mL 的TSG。由图可知，TSG 主要由11 个亚基条带组成，分布在10～70 ku，属于低分子质量蛋白，其中最主要亚基分布在35.34 ku 及13.83 ku 两处，其表达量显著高于其它分子质量的条带。蛋白质的亚基组成及大小能够影响蛋白质的功能性质。种子球蛋白普遍包含碱性亚基及酸性亚基，分子质量分别在20～27 ku 及30～39 ku 内[14]，其中酸性亚基有利于蛋白溶解性的提高，这主要是由于酸性亚基的结构疏松，有利于促进蛋白质分子的伸展及亲水基团的暴露[15]，从而提高蛋白质的溶解性。而碱性亚基则有利于蛋白持油性的提高，降低蛋白的起泡能力，这可能与碱性亚基的疏水基团较多有关[16]。蛋白亚基的大小及酸性亚基和碱性亚基的比例对蛋白溶解性、起泡性、乳化性等功能特性造成一定的影响进而影响其在食品工业中的生产应用，如：蛋白质亚基组成及大小的不同会导致蛋白质局部厚度不同，致使网状结构密度形成差异[17]，蛋白大分子亚基含量的减少，有利于蛋白溶解性、乳化性、乳化稳定性的提高[18]，进而影响产品营养及加工品质。因此，了解蛋白的亚基组成、大小及亚基与蛋白功能特性的关系可为蛋白的开发应用提供科学指导。

图1 TSG 电泳图Fig.1 SDS-PAGE for TSG

2.2 巯基的二硫键含量

采用DTNB 比色法，探究中性条件下TSG 中总巯基、游离巯基及二硫键含量，结果如表1所示。

巯基是蛋白质中最具活性的官能团，可改善蛋白质的结构性质进而致使蛋白质功能特性发生改变[19]，巯基发生氧化反应产生的二硫键是稳定蛋白质构象重要的共价键，其可使肽链的空间结构更紧密，有助于维持蛋白质的三维空间结构[20]，因此，二硫键含量高的蛋白质其结构更趋于稳定。此外，巯基和二硫键具有较高的生物活性，含量高时能显著改善蛋白的结构及表面疏水性、溶解度、乳化性和起泡性[21]，其中表面疏水性与游离巯基含量呈线性正相关，这可能是由于随着游离巯基含量的增加，蛋白质解折叠及疏水性残基的暴露，导致蛋白表面疏水性增强[22]所致。二疏键则在乳化凝胶形成过程中对脂肪的稳定起决定作用[23]，由表1 可知，TSG 中游离巯基含量为（33.97±2.94）μmol/g，二硫键含量为（44.08±3.79）μmol/g，TSG 中巯基及二硫键含量均较高，因此功能性质良好，在食品工业上有极大的开发利用价值。

表1 TSG 中巯基/二硫键的含量Table 1 Content of sulfhydryl/disulfide bond in TSG

2.3 氨基酸

采用PITC 柱前衍生氨基酸分析法对TSG 的氨基酸组成及含量进行分析，结果如表2所示。由表可知TSG 氨基酸种类组成较齐全，总氨基酸含量为528.17 mg/g，其中必需氨基酸含量占总氨基酸含量（E/T）的45.85%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）比值为0.85，均显著高于FAO/WHO 理想蛋白质标准中人体必需氨基酸含量/氨基酸总含量（40%）及人体必需氨基酸含量/非必需氨基酸（0.6）标准值。在8 种必需氨基酸中，异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸及苏氨酸含量最为丰富，其中异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸均高于FAO 中推荐值（异亮氨酸含量4.0%，苯丙氨酸含量6.0%、苏氨酸含量4.0%）。但TSG 中缺少含硫氨基酸——蛋氨酸，推测可能是由于酸水解作用导致氨基酸损失[24]所致。此外田琨等[25]研究表明豆科植物中缺乏蛋氨酸，因此蛋氨酸的缺少也可能与TSG 提取原料有关。含硫氨基酸中除蛋氨酸外还包括半胱氨酸和胱氨酸，是蛋白质中巯基和二硫键的主要来源，二者可通过氧化还原而互变。TSG 中胱氨酸的含量约占总氨基酸含量的5.89%，而青稞蛋白和大豆分离蛋白中仅为1.51%[26]，1.30%[27]，胱氨酸含量的高低直接影响巯基及二硫键的含量，因而致使TSG 巯基和二硫键含量较高。

表2 TSG 氨基酸组成及含量Table 2 Amino acid composition and content of TSG

2.4 溶解性

以大豆分离蛋白为对照组，对相同质量浓度不同pH 值条件下大豆分离蛋白和TSG 的溶解性进行测定，结果如图2所示。由图可知，随着pH值的升高，TSG 和大豆分离蛋白的溶解性均呈现先升高后降低而后逐渐平稳升高的趋势。在极端酸性条件pH 2.5 到等电点时，蛋白质的溶解性发生骤降且在等电点附近时达到最小，其中TSG 溶解性从（87.66±4.87）%降低到（12.58±0.97）%，大豆分离蛋白从（94.96±3.97）%降低到（13.07±0.85）%。随后越偏离等电点，TSG 及大豆分离蛋白的溶解度越高，pH 值到8.5 以后，溶解度趋于稳定上升。由于食品加工过程中不涉及极端酸碱的处理，因此本文着重对pH 4.0～10.0 范围内TSG 及大豆分离蛋白的溶解性进行对比分析，发现TSG 在pH 4.0～10.0 条件下的溶解性优于大豆分离蛋白，在中性条件pH 7.0 时TSG 溶解性为（76.74±2.76）%，比大豆分离蛋白高26.9%。

图2 pH 值对TSG 和大豆分离蛋白溶解性的影响Fig.2 Effect of pH on the solubility of TSG and soybean protein isolate

蛋白质的溶解度能够显著影响其它功能特性，因此常被作为评价其加工价值的重要参数。由于蛋白质具有两亲性，因此其溶解度常受到溶液pH 值环境及离子强度的影响[28]。当溶液pH 值处于蛋白质自身等电点时，蛋白所带电荷数最少，与水分子的作用最弱，此时蛋白质分子间的相互作用力增强，更易发生蛋白质聚集，因而溶解度最低；而在小于或高于等电点的pH 值范围时，蛋白质正、负电荷不平衡，蛋白质同水分子的结合能力增强，溶解度随之增加[29]。蛋白质的氨基酸种类也是影响其亲水性/疏水性平衡[30]及溶解度的重要因素，疏水氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸等可通过疏水键相互结合在蛋白质中心形成疏水区域；亲水氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸等则可与水分子形成位于蛋白外侧的亲水区域[31]。可见蛋白质中亲/疏水程度的差异使其呈现出不同的溶解性，TSG 的亲水性氨基酸含量为54.98%，大豆分离蛋白亲水性氨基酸含量为46.70%，这是TSG 蛋白溶解性高于大豆分离蛋白的主要原因。

2.5 乳化性和乳化稳定性

采用高速剪切法，对不同pH 值条件下大豆分离蛋白和TSG 的乳化性和乳化稳定性进行测定，结果如图3 及图4所示。

pH 值对TSG 和大豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性影响结果如图3所示。由图可知，随着pH值的升高，二者变化趋势保持一致，乳化性呈现先降低后升高的趋势，乳化稳定性则先升高后降低。在等电点pH 4.5 附近时，相较于其它pH 值条件下，两种蛋白的乳化性均最差，乳化稳定性最佳。在pH 4.0～10.0 范围内TSG 的乳化性优于大豆分离蛋白，pH 7.0 时，TSG 及大豆分离蛋白的乳化稳定性相同均为100%。碱性条件pH 9.5 及10.5 时TSG 的乳化性最佳为（60.53±1.81）%和（61.54±3.81）%，分别高于大豆分离蛋白9.25%，8.38%。此外由图4 可知，pH 4.5 时TSG 和大豆分离蛋白的乳液粒径较大，分布不均匀且覆盖率低，此条件下蛋白不足以包裹所有油滴，因而导致乳化性较差。

图3 pH 对TSG 和大豆分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响Fig.3 Effect of pH on emulsification and emulsification stability of of TSG and SPI

图4 不同pH 值下TSG 和大豆分离蛋白的乳液变化及乳化程度Fig.4 Emulsion changes and emulsification degree of TSG and SPI at different pH

蛋白质乳化性和乳化稳定性的影响因素众多，包含介质的pH 值，蛋白溶解度，疏水性基团及分子大小等[32]。稳定的乳状液依赖于蛋白质的溶解度，在等电点处蛋白的正负电荷相互抵消，净电荷为零，蛋白质载量易在乳状液界面达到最高，有利于高黏性膜的形成，因此具有较高的乳化稳定性，且在等电点状态时蛋白质会发生絮凝沉淀，溶解度最小，乳化性较差[33]。当pH 值远离等电点时，蛋白溶解度增加，由于表面活性组分中极性基团的离子化引起静电排斥作用，因而破坏界面膜的结合力[34]，致使乳化性逐渐提高，乳化稳定性下降。同时，蛋白的高溶解度和较小分子尺寸可增强蛋白质分子与脂质之间的相互作用从而提高蛋白的乳化性[35]。此外，乳化性和乳化稳定性还与蛋白质的疏水-亲水平衡有关，疏水-亲水基团间的失衡会导致蛋白的疏水性增加，进而降低其乳化性，适量蛋白质疏水基团的暴露可以促进蛋白质与油分子的相互作用，促使更多的蛋白质包覆在油分子表面，从而降低油水界面张力，提高蛋白的乳化稳定性[36]。另外，增加蛋白质中游离巯基的含量有利于形成二硫键，可促使形成更稳定和致密的界面膜[37]。TSG 的溶解性较好，分子质量较小，游离巯基含量高，这些因素均导致其乳化性能优于大豆分离蛋白。

乳液的油滴粒径及蛋白覆盖率是评价其乳化性及乳化稳定性的重要指标。粒径越小，乳液析出速率越慢，因而乳化液越稳定[38]；同时较小的油滴粒径可使蛋白质形成维持较大表面积的界面膜，增强蛋白质展开和包裹油滴的能力[39]。若蛋白质覆盖率不足或油相大面积暴露，油滴为保持稳定趋于与邻近油滴共享蛋白质，致使蛋白絮凝形成极不稳定的乳液[40]；而当蛋白质覆盖率较高时，蛋白质分子可完全包裹油滴，且蛋白质分子层之间的作用力，如空间排斥和静电排斥等，可使乳液更加稳定。由图3 可知，TSG 和大豆分离蛋白的乳化稳定性均较高，TSG 的乳液平均粒径小，蛋白覆盖率高，这是其乳化性优于大豆分离蛋白的原因。因此，TSG 较高的乳化性和乳化稳定性使其在产品配方和食品工业中得到广泛应用。

3 结论

本文主要研究TSG 的结构，功能特性及构效关系，结果表明TSG 的分子质量分布在10～70 ku，且在35.34 及13.83 ku 处的蛋白表达量最高，为低分子质量蛋白质。TSG 中游离巯基及二硫键含量较高，分别为（33.97±2.94）μmol/g，（44.08±3.79）μmol/g。氨基酸组成分析结果显示TSG 中氨基酸种类较齐全，其中必需氨基酸含量为45.85%，亲水性氨基酸含量为54.98%。对TSG 功能特性检测发现其具有良好的溶解性、乳化性和乳化稳定性，这与构效分析结果相符合。由此可见，蛋白质的功能特性与其分子的大小、巯基二硫键含量、氨基酸构成等因素密切相关。此外，上述结果表明TSG 的分子质量较小，游离巯基及亲水氨基酸含量较高，其溶解性、乳化性优于大豆分离蛋白。因此，该TSG 蛋白在食品工业中拥有广泛的市场前景也为日后TSG 的研究及开发利用提供了一定的科学依据。