发芽糙米糖蛋白抗炎、降血糖性能分析

刘晓飞，侯 艳，马京求，程传兴，林枞雨，张 娜*

（1 哈尔滨商业大学食品工程学院 哈尔滨150076 2 哈尔滨工业大学生命科学与技术学院 哈尔滨150080）

糖蛋白是广泛存在于植物、动物和微生物机体内必不可少的生物大分子，一般由多肽链和低聚糖链共价结合而成[1]。糖链影响多肽链或蛋白质的折叠形态和整体构象。糖链与多肽链或蛋白质连接的特殊结构使糖蛋白有多种存在形式，从而具有多种生物活性[2]。糖蛋白具有预防肿瘤[3]，抗氧化，降胆固醇[4]，提高机体免疫力等作用。糙米发芽过程的实质是糙米活化[5]。发芽使糙米内部的多种酶被激发并且释放，从结合状态转化为游离状态，释放出更多的营养物质。发芽后的糙米不仅含原有的肌醇六磷酸盐、膳食纤维、多种抗氧化物质以及游离态微量元素和多种维生素[6]，还含有新生成的营养物质如γ-氨基丁酸等[7]。其中蕴含的营养成分和活性物质显著提高，食用和保健功能大幅度增加。有研究表明，糙米发芽后，其糖蛋白性能也有所改变，糖蛋白含量随着萌发时间的延长而增加，且抗氧化性与萌发时间呈正相关[8]。目前国内外对GBRG 的相关研究鲜有报道。

本试验采取超声辅助提取GBRG，用DEAECellulose 52 阴离子交换层析法、Sephadex G-200凝胶层析法分离纯化，对纯化的GBRG 进行抗炎和降血糖性能分析。为进一步探寻消除炎症，改善胰岛素抵抗的天然药物功能性食品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发芽糙米粗糖蛋白样品制备 供试粳稻为“龙粳”，用龚谷机去除稻子外壳得到糙米，按照文献[9]将糙米发芽并制备发芽糙米粗糖蛋白样品，冻干保存备用。

1.1.2 试剂 DEAE-Cellulose 52，日本Pharmacia集团；脂多糖，北京索莱宝有限公司；硫酸、磷酸、乙酸、氯化铁、碘化钾、苯酚、硫酸铜、邻二氮菲、铁氰化钾、盐酸羟胺、邻苯三酚、硫酸亚铁、吡啶、乙酸酐、盐酸（分析纯）等，南京生物化学试剂研究中心；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖，上海和氏璧化工有限公司。

1.2 仪器与设备

680 型酶标仪，日本Bio-Rad 集团；CKX41 型倒置显微镜，日本Olympus 公司；Bj5060UV 型CO2培养箱，美国Heraeus 研究中心；DL-CJ-IN 型超净工作台，南京医疗仪器制造中心；T25 细胞培养瓶、24 孔细胞培养板、96 孔细胞培养板，德国Corning 公司。

1.3 方法

1.3.1 发芽糙米粗糖蛋白的分离纯化 分离纯化流程 GBRG 粗品→上DEAE-Cellulose 52 阴离子柱→蒸馏水洗柱→氯化钠洗柱→绘制梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、除盐、浓缩、冻干→溶于蒸馏水→上Sephadex G200 琼脂糖凝胶柱→氯化钠洗柱→确定梯度洗脱曲线→洗脱峰透析、浓缩、冻干备用。

每一步获得的GBRG 均使用考马斯亮蓝法、苯酚-硫酸法检测其多糖及蛋白质含量。GBRG 经DEAE-Cellulose 52 阴离子交换层析和Sephadex G200 琼脂糖凝胶柱层析[10]，得到3 个糖蛋白组分峰，分别命名为WEG、SEG-1 和SEG-2。采用高效液相色谱、红外光谱、圆二色性、1H-NMR 谱等方法进行结构分析，证明3 个GBRG 组分峰具有显著的糖蛋白特征[10]。

1.3.2 GBRG 的抗炎作用研究

1.3.2.1 细胞模型的建立 参照Xie 等[12]、Kim等[13]的试验方法并加以调整，经100 ng/mL LPS 诱导RAW264.7 细胞，建立细胞炎症模型。

1.3.2.2 MTT 法测定细胞增殖活性 选用96 孔培养板，分为3 组：空白、对照、样品，3 孔/组。将处于对数生长期的RAW264.7 细胞配成浓度1×105个/mL 的细胞悬液，各孔添加100 μL，进行培育[14]，过夜待用。各组分GBRG 溶于细胞培养液，终浓度为滤膜微孔过滤，混入100 μL 浓度不一的含GBRG 的培养液，再把培养板放于37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中，连续孵育24 h，混入200 μL 5 mg/mL MTT 溶液/孔，培育4 h。使用1 mL 注射器收集各孔中的上清液，与100 μL DMSO 混合，振动摇匀8 min 使结晶物全部溶解，570 nm 检测细胞相对活力[15]。

细胞相对活性=（样品组-空白组）/（对照组-空白组）×100%

1.3.2.3 RT-PCR 测定细胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β 和iNOS 的表达

1）细胞分组 将RAW264.7 细胞接于96 孔板（5×105个/mL），划分成4 组，培育过夜[16]，各组包括3 个重复孔。正常组：未加入LPS；LPS 组：LPS 质量浓度是1 μg/mL；WEG 糖蛋白组（50，100，200 μg/mL）+1 μg/mL LPS；SEG-1 糖蛋白组（50，100，200 μg/mL）+1 μg/mL LPS；SEG-2 糖蛋白组（50，100，200 μg/mL）+1 μg/mL LPS。先向细胞中添加各浓度糖蛋白，1 h 后加入LPS 孵化24 h。

2）引物设计 按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS 与TNF-α 的基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成。具体内容如表1所示：

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

3）RNA 提取 选择总RNA 试剂盒用以提取RAW264.7 细胞的总RNA，测定RNA 浓度。

4）逆转录反应 逆转录反应的试剂为50 ng～5 μg 总RNA、1 μL 引物Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）、10 μL 2×ES 反应液、1 μL RT/RI 逆转录酶、1 μL gDNA。将RNA 模板、引物和DEPC 水混合，65 ℃孵育5 min 后，冰浴2 min，加入引物Oligo（dT）18，用于逆转录试验。42 ℃孵育15 min，最后85 ℃孵育，使RT/RI 与gDNA 酶进行逆转录反应。

5）PCR 扩增 对逆转录所得到的cDNA 进行PCR。在PCR 管中加入SYBR Green 染料5 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、待测cDNA 5 μL、DEPC 水2.4 μL。低速离心30 s，使管内溶液完全混合，然后用Realtime PCR 仪进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃，5 min 预变性；65 ℃、2 min，94 ℃、2 min，共30 个循环。

1.3.3 GBRG 降血糖作用研究1.3.3.1 各组分GBRG 对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定 参考文献[17]，将各组分GBRG 配成0.5 mg/mL 的溶液，取0.60 mL 磷酸缓冲液（0.05 mol/L pH 6.8）和0.20 mL α-葡萄糖苷酶酶液（0.2 U/mL）与0.10 mL 各组分GBRG 液分别进行混合，作为待测样品，将样品37 ℃水浴10 min 后，加入20 mmol/L 的PNPG 溶液0.20 mL。5 min 后加入1 mL 1 mol/L 的Na2CO3溶液终止反应。对照组为阿卡波糖，405 nm 处测定其吸光值，并计算各组分GBRG 对α-葡萄糖苷酶的抑制率，筛选出抑制α-葡萄糖苷酶的活性最显著的糖蛋白组分进行后续研究。

1.3.3.2 具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的GBRG组分的抑制率及半数抑制浓度的测定 将筛选出对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最明显的GBRG组分溶解，配成1.00，0.50，0.20，0.10，0.05，0.01 mg/mL 备用，按照1.3.2.1 节所述方法，求出50%抑制率对应的α-葡萄糖苷酶抑制剂的浓度，即为GBRG 组分的半数抑制浓度（IC50）。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为（1）。

1.3.3.3 各组分GBRG 对α-淀粉酶抑制活性的测定 参考文献[18]，用α-淀粉酶（2 U/mL）溶液与0.2 mL 各组分GBRG 溶液（1 mg/mL）在37 ℃预混合10 min，以0.3 mL 5%的淀粉溶液为底物，孵育15 min。加入2 mL DNS 试剂，100 ℃加热15 min，测定其在540 nm 处的吸光度。试验重复3次，取平均值。

1.3.3.4 具有α-淀粉酶抑制作用的GBRG 组分对α-淀粉酶的抑制率及半数抑制浓度的测定选择对α-淀粉酶具有最明显抑制作用的GBRG组分配成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL 溶液备用，按照1.3.2.3 节所述方法，求出50%抑制率对应的α-淀粉酶抑制剂的浓度，即为GBRG 组分的半数抑制浓度（IC50）。α-淀粉酶的抑制活性计算公式为（2）。

式中：Ac——不加样品的α-淀粉酶溶液吸光度；A'c——不含样品和α-淀粉酶的吸光度；As——含样品但不含α-淀粉酶的吸光度；A's——无α-淀粉酶的样品溶液吸光度。

2 结果与讨论

2.1 GBRG 的抗炎作用研究结果分析

2.1.1 不同GBRG 组分对细胞增殖影响结果MTT 法测定不同浓度WEG、SEG-1 和SEG-2 糖蛋白组分对RAW264.7 存活率的影响结果如图1所示。

图1 GBRG 对RAW 264.7 巨噬细胞活性的影响Fig.1 Effect of germinated brown rice glycoprotein on RAW 264.7 macrophage activity

由图1 可知，糖蛋白在低浓度时，对经LPS 诱导后的RAW264.7 细胞生长并无抑制效果，细胞的存活率较高；在中浓度时，抑制的作用稍显提高，细胞的存活率下降，但基本高于对照组；高浓度时，抑制作用减弱，细胞存活率有所提升。结果表明：当糖蛋白溶液质量浓度在0.025～0.2 mg/mL时，对RAW264.7 细胞没有毒性且细胞存活率高于对照组。

2.1.2 RT-PCR 测定细胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β 和iNOS 的表达结果

2.1.2.1 糖蛋白WEG 对LPS 诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响 糖蛋白WEG 对LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症因子表达如图2所示。

图2 糖蛋白WEG 对LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 iNOS、COX-2、TNF 和IL-1β mRNA 表达水平的影响Fig.2 Effects of glycoprotein WEG on the expression of RAW264.7 iNOS，COX-2，TNF and IL-1β mRNA in mouse macrophages induced by LPS

由图2 可知，与空白组相比，经1 μg/mL 的LPS 诱导1 d 后，可以增加小鼠巨噬细胞RAW264.7 iNOS、COX-2、TNF-α 与IL-1β mRNA的相对表达水平（P＜0.01），其值分别为1.03，0.873，0.891 与0.911。WEG 和诱导后的RAW264.7细胞一起培养1 d 后，和LPS 的对照组相比，低剂量组均可以调节iNOS、COX-2 及IL-1β mRNA的相对表达水平，而中、高剂量组iNOS、COX-2 和IL-1β mRNA 的相对表达水平显著下降（P＜0.05），降至最低值各为0.571，0.549，0.544；对于炎症因子TNF-α，低、中、高剂量都可降低mRNA 的相对表达水平，从0.648 降至0.247，且呈剂量依赖关系。

思雨来到岳母家，快10点了。还好，灯还亮着。思雨轻轻地敲了敲门。门里有人问“谁？”思雨平静地回答：“田诗，是我，你姐夫。”门开了，思雨的小姨子田诗还没睡，在看电视。田诗有些焦急地问：“姐夫，这三更半夜的到底出了什么事？”思雨笑着安慰道：“田诗，啥事没有。我们一帮哥们在你家附近的酒店里拼酒，我的胃今日不太好，就先逃跑出来。看你的灯还亮着，就想上来吃点面条啥的，顺便也看看妈。”田诗一听，抿嘴笑了：“姐夫，想吃面条就吃，还借看妈的幌子。妈睡了。我给你下面条去。”

2.1.2.2 糖蛋白SEG-1 对LPS 诱导得RAW264.7细胞炎症因子表达的影响 糖蛋白SEG-1 对LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症因子表达如图3所示。

由图3 可知，与空白组相比，经1 μg/mL 的LPS 诱导1 d 后，炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA 的相对表达水平极显著上升（P＜0.01），分别达到1.341，1.387，0.871 和0.915。低剂量的SEG-1 对iNOS、COX-2、TNF-α 和IL-1β mRNA 的相对表达水平有显著的降低作用（P＜0.05），分别降至0.967，1.053，0.72 和0.693。中、高剂量的SEG-1 对于IL-1β、TNF-α、COX-2 和iNOS mRNA 的相对表达水平有极显著的作用（P＜0.01），尤其是在对TNF-α 炎症因子上。各表达水平最低降至0.574，0.587，0.221 和0.492。

图3 糖蛋白SEG-1 对LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 iNOS、COX-2、TNF 和IL-1β mRNA 表达水平的影响Fig.3 Effect of glycoprotein SEG-1 on the expression of RAW264.7 iNOS，COX-2，TNF and IL-1β mRNA in mouse macrophages induced by LPS

2.1.2.3 糖蛋白SEG-2 对LPS 诱导得RAW264.7细胞炎症因子表达的影响 糖蛋白SEG-2 对LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症因子表达如图4所示。

由图4 可知，小鼠巨噬细胞RAW264.7 经过1 μg/mL 的LPS 催化刺激后，较空白组而言，4 种炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α 及IL-1β mRNA相对表达水平都有显著上升（P＜0.05），分别升至0.918，0.965，1.084 和0.927。低剂量的SEG-2 对炎症因子COX-2、TNF-α 的mRNA 相对表达水平下降效果显著（P＜0.05），对炎症因子iNOS 和IL-1β 的mRNA 表达下调效果极显著（P＜0.01），中、高剂量的SEG-2 对TNF-α、COX-2 的mRNA 下调效果显著（P＜0.05），对炎症因子iNOS 和IL-1的mRNA 表达下调效果极显著（P＜0.01），相对表达水平最低降至0.148，0.387，0.566 和0.237。

图4 糖蛋白SEG-2 对LPS 诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 iNOS、COX-2、TNF 和IL-1β mRNA 表达水平的影响Fig.4 Effects of glycoprotein SEG-2 on the expression of RAW264.7 iNOS，COX-2，TNF and IL-1β mRNA in mouse macrophages induced by LPS

2.2 GBRG 的降血糖作用研究结果分析

2.2.1 各组分GBRG 对α-葡萄糖苷酶抑制活性的结果分析

各组分GBRG 对α-葡萄糖苷酶抑制率的测定结果如图5所示。

由图5 可知，3 种GBRG 组分均具有一定的α-葡萄糖苷酶的抑制效果。水洗糖蛋白WEG 对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最弱，抑制率为36.67%；盐洗糖蛋白SEG-1 对α-葡萄糖苷酶的抑制效果强于WEG，抑制率为52.27%；SEG-2 对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最强，抑制率高达65.71%。表明SEG-2 组分中的酶抑制物质的含量最高。

图5 各组分GBRG 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.5 The inhibitory effect of each component GBRG on α-glucosidase

2.2.2 SEG-2 的α-葡萄糖苷酶抑制率及半数抑制浓度的测定结果分析 SEG-2 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的结果如图6所示。

由图6 可知，质量浓度在0～0.6 mg/mL 的范围内，SEG-2 抑制α-葡萄糖苷酶的能力随SEG-2浓度的增加而提高。其浓度与抑制率呈线性相关关系，回归方程为Y=58.97X+23.064，R=0.9905，求其IC50是0.46 mg/mL。在0.6～1.0 mg/mL 范围内，随着SEG-2 浓度的增大，α-葡萄糖苷酶抑制率较平缓，在0.6 mg/mL 时，SEG-2 对α-葡萄糖苷酶抑制率与对照组最为接近。因此，糖蛋白SEG-2 在整体上具有良好的酶抑制活性，并且在0.6 mg/mL的质量浓度下抑制效果最佳。

图6 SEG-2 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of SEG-2 on α-glucosidase

2.2.3 各组分GBRG 对α-淀粉酶抑制活性的结果分析 各组分GBRG 对α-淀粉酶抑制率的测定结果如图7所示。

由图7 可知，3 种GBRG 组分均对α-淀粉酶有较强的抑制效果。水洗糖蛋白WEG 抑制α-淀粉酶的能力最弱，抑制率为52.5%；盐洗糖蛋白SEG-1 抑制α-淀粉酶的能力弱于SEG-2，抑制率为58.5%；而SEG-2 抑制α-淀粉酶的能力最强，抑制率可达64.5%。尽管3 种糖蛋白对α-淀粉酶有所抑制，但总体上稍弱于阿卡波糖。

图7 各组分糖蛋白对α-淀粉酶的抑制作用Fig.7 The inhibitory effect of each component GBRG on α-amylase

2.2.4 SEG-2 的α-淀粉酶抑制率及半数抑制浓度的测定结果分析 SEG-2 对α-淀粉酶的抑制作用的结果如图8所示。

如图8所示，在质量浓度处于0～1 mg/mL 范围内，SEG-2 的α-淀粉酶抑制率与糖蛋白浓度成正比例关系。当质量浓度为1 mg/mL 时，SEG-2 的抑制率可达到54.26%。一定范围内，抑制率与SEG-2 浓度呈线性相关，其回归方程为Y=39.074X+14.36，R=0.9962，求得IC50为0.912 mg/mL。SEG-2 与阿卡波糖的抑制能力均随浓度的增加而不断提高，表明糖蛋白SEG-2 具有较好的α-淀粉酶抑制能力，但弱于阿卡波糖。

图8 SEG-2 对α-淀粉酶的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of SEG-2 on α-amylase

3 结论

天然植物糖蛋白不仅具有广泛的抗肿瘤和抗氧化能力，还能增强人体免疫力，抑制细菌生长，调节机体大部分的生命活动。大多数蛋白质是糖蛋白。本试验以GBRG 为原料，研究其抗炎、降血糖作用。Li 等[19]发现莲子糖蛋白可以有效抑制炎症因子NO 的产生，抑制经LPS 刺激后的小鼠巨噬细胞RAW264.7 中炎症介质的产生。夏炎等[20]发现，蒲公英糖蛋白可以通过调控NF-κB 信号的转导通路，显著抑制TNF-α 和IL-6 的分泌及TNFα、IL-6 和iNOS mRNA 的表达以及NO 的合成，从而发挥其抗炎作用。乔春雷[21]从淫羊藿中提取的糖蛋白可抑制与血糖代谢相关酶的活性，并对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用呈剂量依赖性；刘主等[22]从甘薯中提取的糖蛋白可对经四氧嘧啶诱导后的糖尿病患病小鼠有较强的降血糖作用。

本文通过试验手段，分离纯化所提取的GBRG，获取不同的3 种糖蛋白组分WEG、SEG-1和SEG-2。对这3 种糖蛋白进行经LPS 诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 抗炎症试验和α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制能力测定，筛选出具有良好降血糖作用和抗炎症能力的糙米糖蛋白WEG-2，为补充或代替化学药物的深度开发提供参考，同时对促进我国农业和稻谷的可持续发展具有重大意义。但对GBRG 的深入研究还有很长的科研之路要走，依旧要利用更高端的设备与科技来开展全方面的探析，便于更全面地发挥出GBRG 的有益作用。