细胞水平染料木素协同维生素D3的抗骨质疏松作用

赵 佳，姜 波，郭建丽，张丹洋，孙文辉，包永明，3*

（1 大连理工大学生物工程学院 辽宁大连116024 2 大连理工大学盘锦产业技术研究院 辽宁盘锦124221 3 大连理工大学海洋科学与技术学院 辽宁盘锦124221

骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病[1]。世界卫生组织在2015年提出的《关于老龄化与健康的全球报告》指出，在国家和全球层面上需要重新和持续关注改善肌肉骨骼健康[2]。骨重建过程取决于维持成骨细胞形成骨基质与破骨细胞消除骨矿化之间的平衡。成骨细胞响应骨细胞产生的信号，并将破骨细胞前体募集到重塑部位，然后，通过骨保护素（OPG）/核因子κB 配体受体激活剂（RANKL）/核因子κB 受体激活剂（RANK）系统的受体激活剂，成骨细胞可调节破骨细胞的生成[3]。

骨质疏松症主要是体内维生素D 缺乏，钙摄入量不足以及雌激素下降引起的。目前，人们普遍接受雌激素替代疗法用于治疗因缺乏雌激素的骨质疏松症患者。然而其有副作用，尤其是增加乳腺癌的风险[4]。维生素D3（Vitamin D3，VD3）是骨形成系统中的重要参与者，在钙稳态中具有增加钙从肠道吸收的功能[5]。饮食中摄入足够的维生素D3是必要的，其广泛存在于油性鱼和鳕鱼肝油中[6-7]。染料木素（Genistein，Gen）是常见的异黄酮植物雌激素化合物之一，在大豆中的含量丰富[8]，也是可食用的天然物质，能够有效降低副作用。

目前已有大量从细胞及动物水平上研究关于维生素D3或者染料木素对骨质疏松症的影响[5，9]。维生素D3及染料木素在促进成骨细胞的分化过程中存在协同作用[10]，协同诱导成骨细胞活化并阻止破骨细胞的分化[11]。适当剂量的染料木素与钙和维生素D3结合被视为预防和管理骨质流失的一种新的潜在疗法[12]。

本文在细胞水平上验证维生素D3和染料木素对治疗骨质疏松症的协同作用，并研究维生素D3和染料木素在破骨细胞形成中的作用，为通过维生素D3治疗骨质疏松症提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.7、人成骨肉瘤细胞MG-63，均购自中国科学院上海细胞库。

DMEM 培养基（无酚红）、Trizol 试剂、胰蛋白酶，上海生工生物有限公司；Western 及IP 细胞裂解液，碧云天生物技术；染料木素、维生素D3，维克奇生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma-Aldrich 公司；抗坏血酸、茜素红S 染色液（1%，pH 4.2）、西吡氯铵（CPC）、β-甘油磷酸钠，北京索莱宝科技有限公司；核因子κB 受体活化因子（RANKL），美国ROCKLAND 公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒，南京建成生物工程研究所；噻唑蓝（MTT）、琼脂糖，美国Invitrogen 有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动凝胶成像系统，英国Syngene 公司；IX71 荧光显微镜，日本Olympus 公司；Flash 全波长扫描荧光酶标仪、7500 Real Time PCR System，美国赛默飞公司；垂直层流洁净工作台，上海净化设备有限公司；Hera cell 150 二氧化碳培养箱、Biofuge Stratos 冷冻离心机，美国赛默飞公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养 人成骨肉瘤细胞MG-63 和小鼠巨噬细胞RAW264.7 均在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养[13]，培养基使用含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素和链霉素）的无酚红DMEM 培养基。

1.3.2 MTT 法测定细胞增殖 取生长状态良好的对数生长期人成骨肉瘤细胞MG-63 或者小鼠巨噬细胞RAW264.7，以每孔5×103个接种于96 孔板中。待细胞贴壁后，给药组分别加入不同浓度的染料木素、维生素D3，对照组加入等体积的培养基。药物作用一定时间后吸除96 孔板中的培养基，在37 ℃环境下，每孔用100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）孵育4 h。小心吸除孵育后的MTT 溶液，每孔用100 μL DMSO 溶解紫色结晶甲瓒，轻柔混匀。使用酶标仪以630 nm 波长处的A值作为参照，检测570 nm 波长处的吸光度A值。

1.3.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定 人成骨肉瘤细胞MG-63 以每孔2×105个接种于6 孔板，待细胞贴壁后，给药组添加不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养基培养一定时间。检测时用PBS洗2 遍，每孔加入150 μL 的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30 min 后，4 ℃下离心15 min，转速为14 000 r/min，吸取上清液置于冰上，测定ALP 活性严格按照ALP 试剂盒说明书操作，检测波长520 nm。

1.3.4 茜素红染色鉴定骨矿化 人成骨肉瘤细胞MG-63 以每孔2×105个接种于6 孔板，待细胞贴壁后，矿化组和给药组均换用含50 μmol/L 抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM 培养基培养，给药操作同1.3.3 节。每天观察细胞状态，每1～2 d 更换培养基1 次。21 d 后在倒置显微镜下观察，部分细胞成片积累生长，出现形状各异的“黑斑”，即为矿化结节。PBS 清洗细胞2 遍晾干，95%乙醇固定10 min，蒸馏水清洗后晾干。加入茜素红S 染色液（1%，pH 4.2），37 ℃染色60 min。蒸馏水清洗2～3 遍将未结合的染料洗掉，动作轻柔避免洗掉细胞，晾干后倒置显微镜下拍照并记录。每孔加1 mL 10% CPC 溶液充分溶解深红色化合物，测定其在550 nm 下A值，钙结节的量与A值的大小成正比，以定量钙沉积情况[14]。

1.3.5 诱导破骨细胞 小鼠巨噬细胞RAW264.7，以1×104/孔接种于24 孔板，待细胞贴壁后，加入含50 ng/mL RANKL 诱导剂的培养基诱导破骨细胞生成。诱导6 d 后在倒置显微镜下可观察到有多核细胞的形成，根据抗酒石酸酸性磷酸酶染液说明进行染色，倒置显微镜下观察拍照。记录到含有大于3 个细胞核的TRAP 阳性多核细胞为破骨细胞[15]。

1.3.6 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性检测 小鼠巨噬细胞RAW264.7 以每孔5×103个接种于6 孔板中，每孔2.5 mL。细胞贴壁后，给药组和对照组均用含RANKL 诱导剂（50 ng/mL）的培养基培养细胞，给药组加入不同浓度的不同药物。每1～2 d 更换培养基1 次，培养6 d。处理结束后，收集细胞，PBS 洗1～2 遍，每孔加入150 μL的细胞裂解液裂解细胞，置冰上30 min 后，在4℃下离心15 min，转速为14 000 r/min，取上清液为总蛋白置于冰上，测定TRAP 活性严格按照TRAP 试剂盒说明书操作，检测波长530 nm。

1.3.7 人成骨肉瘤细胞MG-63 的RNA 提取及RT-PCR 将MG-63 细胞以每孔1×105个接种于6 cm 培养板，细胞贴壁后加入药物（分组及给药情况同1.3.3 节）。培养24 h 后收集细胞。用Trizol 提取总RNA 进行RT-PCR 扩增。PCR 扩增反应条件：采用两步PCR 反应程序法，第一步预变性95℃、30 s；第二步PCR 反应，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，循环40 次。目的基因mRNA 水平以与参照基因GAPDH 的Tm 比值表示。PCR 引物序列如表1所示。

表1 MG-63 细胞PCR 引物序列Table 1 Primers for PCR in MG-63

1.3.8 破骨细胞的RNA 提取及RT-PCR 参照1.3.6 节方法处理细胞。细胞提取RNA 及RT-PCR方法同1.3.7 节。

表2 由RAW 264.7 细胞诱导的破骨细胞PCR 引物序列Table 2 Primers for PCR in osteoclasts induced by RAW 264.7

1.3.9 试验数据处理及统计分析 所得数据为±s表示，n≥3，使用邓肯字母标记法标记多重比较，采用SPSS 19.0 统计软件进行方差的T 检验分析。P＜0.05 差异具有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 维生素D3 联合染料木素对MG-63 细胞增殖和分化的影响

采用MTT 法测定药物作用细胞24 h 后MG-63 的细胞存活率。如图1a所示，维生素D3在1.56～100.00 μmol/L 浓度对MG-63 细胞无毒性，在6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μmol/L 浓度可明显促进MG-63 细胞的增殖（P<0.05）。如图1b所示，染料木素在1.56～50.00 μmol/L 浓度对MG-63 细胞无毒性。染料木素浓度在3.12，6.25 和12.50 μmol/L 可显著促进MG-63 细胞的增殖（P<0.05）。故选择1.56，3.12，6.25，12.50，25.00，50.00 μmol/L 浓度进行组合。如图1c所示，低浓度的维生素D3和染料木素联合用药对MG-63 细胞的增殖具有协同作用，且浓度在6.25 μmol/L 时更为显著。

图1 染料木素和维生素D3 对MG-63 细胞增殖的影响Fig.1 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of MG-63 cells

ALP 作为成骨细胞分化的前期标志之一，可随着成骨细胞的生长而表达增加，可以代表骨形成的状态[16]。药物作用48 h 后测MG-63 细胞的ALP 活性。如图2a 和2b所示，药物浓度在3.12～50.00 μmol/L 时，与染料木素和维生素D3单药组相比，联合组可显著增强MG-63 细胞中ALP 活性。维生素D3在浓度为3.12 μmol/L 和6.25 μmol/L 时抑制了ALP 活性，而联合染料木素可使维生素D3对ALP 活性的抑制作用逆转。染料木素浓度在3.12，6.25，12.50 μmol/L 时可显著增强ALP 活性。

交联的蛋白质和胶原蛋白随着成骨细胞生长增殖，可产生羟基磷灰石并堆积在基质中矿化[17]，茜素红可结合形成的钙结节发生颜色变化，产生深红色的化合物。选择浓度为6.25 μmol/L 的维生素D3，染料木素及其二者联合用药组进行钙结节的检测。矿化培养21 d 后，可在倒置显微镜下观察到MG-63 细胞中的钙结节，矿化组和试验组形成了更多的不透明结节。如图2c所示，积累的钙结节被茜素红染成深红色化合物，形状不规则，表明有成骨活性。加入10%的西吡氯铵（CPC）溶解结合钙结节的茜素红以定量钙沉积情况，在550 nm 下测量吸光度值，如图2d所示，表明维生素D3联合染料木素可形成更多茜素红和钙产生的深红色化合物促进矿化基质的形成。

图2 染料木素和维生素D3 对MG-63 细胞分化和矿化的影响Fig.2 Effects of genistein and vitamin D3 on differentiation and mineralization of MG-63 cells

2.2 染料木素和维生素D3 对MG-63 细胞OPG、RANKL 表达的影响

药物作用24 h 后，采用PT-PCR 方法通过比较Ct 法测定OPG 和RANKL 在成骨细胞的相对表达量。如图3a 和3b所示，与对照组相比，单药染料木素组和维生素D3组的OPG mRNA 表达量均增加；而且与单药组相比，染料木素联合维生素D3组OPG mRNA 表达量显著增加，但增加的作用不是呈剂量依赖性的。如图3c 和3d所示，与对照组相比，染料木素和维生素D3组的MG-63 细胞中RANKL mRNA 表达均降低。在浓度为6.25～50.00 μmol/L 范围内，联合组的RANKL mRNA 表达比维生素D3组显著降低，而与染料木素组对比无差异。OPG 与RANKL 的相对比例破坏可能导致骨吸收增加，微结构改变和骨折风险，在破骨细胞生物学和骨吸收调节中起到关键决定因素和最终步骤的作用[18-19]，如图3e 和3f所示，联合组中OPG/RANKL 的比值显著大于维生素D3和染料木素组，且染料木素、维生素D3以及维生素D3与染料木素联合组对OPG/RANKL 的比值均随着药物浓度的增大而减小。表明维生素D3与染料木素联合可能通过OPG/RANKL 途径对成骨细胞增殖分化产生协同作用。此外，染料木素对MG-63 细胞的增殖和分化作用较维生素D3显著。

图3 染料木素和维生素D3 对MG-63 细胞OPG 和RANKL mRNA 表达的影响Fig.3 Effects of genistein and vitamin D3 on the expression of OPG and RANKL mRNA in MG-63 cells

2.3 染料木素和维生素D3 对破骨细胞增殖及其TRAP 活性的影响

RAW264.7 细胞用含50 ng/mL RANKL 的培养基培养6 d，如图4所示，RAW264.7 细胞可诱导为圆形、椭圆形或不规则多核破骨细胞，并在细胞周围可以看到凸起的伪足。表明RAW264.7 细胞可诱导为成熟的破骨细胞用于试验。

图4 显微镜下破骨细胞的形态Fig.4 Morphology of osteoclasts under microscope

通过MTT 法测定染料木素和维生素D3作用6 d 对RAW264.7 细胞生长的影响。如图5a所示，1.56～50.00 μmol/L 浓度的染料木素对RAW264.7细胞无毒性，如图5b所示，3.12～100.00 μmol/L 浓度的维生素D3对RAW264.7 细胞无毒性。

图5 染料木素和维生素D3 对RAW264.7 细胞增殖的影响Fig.5 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of RAW264.7 cells

通过MTT 法测定染料木素和维生素D3作用24 h 对破骨细胞增殖的影响。如图6a所示，浓度在1.56～50.00 μmol/L 范围内染料木素对破骨细胞增殖具有显著抑制作用。如图6b、6d所示，浓度在6.25～50.00 μmol/L 范围内维生素D3对破骨细胞增殖具有显著的促进作用，与染料木素联合使用后，这种促进作用受到抑制。与对照组相比，联合组在3.12～50.00 μmol/L 浓度下破骨细胞的增殖受到显著抑制，而在3.12～25.00 μmol/L 浓度下，与染料木素组相比，破骨细胞的增殖受到抑制。结果表明，维生素D3可以促进破骨细胞的增

图6 染料木素和维生素D3 对破骨细胞增殖的影响Fig.6 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of osteoclasts

殖，但与染料木素结合可以抑制破骨细胞的增殖。

采用TRAP 试剂盒测定药物作用于破骨细胞24 h 后对TRAP 活性的影响。如图7所示，染料木素、维生素D3和联合用药组均显著抑制破骨细胞的TRAP 酶活性。联合用药组相比单药抑制作用更强。

图7 染料木素和维生素D3 对破骨细胞TRAP 活性的影响Fig.7 Effects of genistein and vitamin D3 on TRAP activity of osteoclasts

2.4 染料木素和维生素D3 对破骨细胞TRAP，MMP9 和组织蛋白酶K mRNA 表达的影响

如图8a所示，与对照组相比，试验组中破骨细胞的TRAP mRNA 表达均被抑制，且联合组的抑制作用更显著。如图8b所示，与对照组相比，试验组中对破骨细胞TRAP mRNA 表达抑制作用随浓度增加而减弱。如图8c 和8d所示，与对照组相比，试验组破骨细胞中MMP9 mRNA 的表达均被抑制，而与染料木素和维生素D3单组相比，联合组中MMP9 mRNA 的表达显著降低，并且当浓度增加时，抑制作用减弱。如图8e、8f所示，染料木素对破骨细胞中组织蛋白酶K mRNA 的表达有明显的抑制作用，但在6.25～50.00 μmol/L 的浓度下，维生素D3却显著促进了组织蛋白酶K 的表达。所以，染料木素逆转了维生素D3对组织蛋白酶K mRNA 表达的促进作用，使联合组对其表达量明显降低。

图8 染料木素和维生素D3 对破骨细胞TRAP，MMP9 和组织蛋白酶K mRNA 表达的影响Fig.8 Effects of genistein and vitamin D3 on the expression of osteoclast TRAP，MMP9 and Cathepsin K mRNA

3 结论

试验数据显示染料木素和维生素D3联合使用比单独用药对成骨细胞的增殖具有显著的促进作用，同时也对破骨细胞有显著的抑制作用。证实染料木素和维生素D3对促进成骨细胞增殖和抑制破骨细胞增殖具有协同作用。维生素D3与染料木素联合用药作用于MG-63 细胞，ALP 活性明显增强，说明二者联合能促进成骨细胞的早期分化，与文献报道过的黄酮促进成骨细胞分化一致[24]。通过10%的CPC 将钙结节量化，得出联合用药能促进钙结节的生成，促进成骨细胞矿化。本文还测定了OPG、RANKL mRNA 的相对表达量，并比较了不同浓度不同组的OPG/RANKL 比值。发现维生素D3和染料木素联合可能是通过OPG/RANKL/RANK 通路促进成骨细胞成熟，有待进一步研究。

本文通过对破骨细胞TRAP 活性检测以及TRAP、MMP9、组织蛋白酶K mRNA 的表达，发现维生素D3和染料木素联合用药能抑制破骨细胞的分化成熟。维生素D3在6.25～50.00 μmol/L，可显著促进破骨细胞成熟和组织蛋白酶K 的表达，同时显著抑制破骨细胞成熟的标记因子MMP9 的表达。维生素D3和染料木素的组合可显著抑制破骨细胞的增殖和分化，染料木素在试验剂量内逆转了维生素D3对破骨细胞的促进作用。

本文证实，染料木素可增强成骨细胞MG-63的增殖和分化，从而促进抗骨质疏松作用。有趣的是，高剂量的维生素D3可促进破骨细胞的增殖成熟从而促进骨质疏松作用，但是在维生素D3和染料木素联合使用时，这种作用可以逆转，抗骨质疏松作用也很明显。染料木素和维生素D3在抗骨质疏松症上的协同作用提供了一种新颖而有效的组合，在骨质疏松症的饮食疗法中具有应用的潜力。