阿托伐他汀对急性肺栓塞大鼠SIRT2/NF-κB通路及动脉血气指标的影响

梁蔚繁 李朝锋

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)是呼吸科常见的疾病，由外源性或内源性血栓堵塞肺血管引起，起病隐匿，早期难以及时诊断，病情发展迅速，且致死、致残率较高[1,2]。APE后的肺血循环障碍可导致患者肺组织缺血、缺氧，引发严重的炎性反应，使得肺组织发生充血水肿，破坏肺部换气功能，造成肺功能障碍[2,3]。SIRT2/NF-κB是机体调控炎性反应的重要信号通路，APE引起的肺组织缺血、缺氧可下调SIRT2表达，抑制NF-κB蛋白去乙酰化，促使其向核内转移，激活促炎因子表达，引发炎症并加快其进展；激活SIRT2信号，可增强NF-κB的去乙酰化，抑制其核移位，进而阻止炎症的发生发展，改善APE诱导的肺动脉高压、低氧血症和肺功能衰竭症状[4-6]，表明SIRT2/NF-κB是治疗APE的作用靶点。阿托伐他汀是一类他汀类药物，具有抗炎、降低胆固醇、改善心血管功能的作用，能显著抑制冠状动脉微栓塞导致的心肌炎性反应，减轻心肌损伤，改善心功能，还可降低APE患者肺动脉平均压，抑制肺血管重构，改善其临床症状[7,8]。但阿托伐他汀对APE大鼠SIRT2/NF-κB通路及动脉血气指标的影响目前还未见明确阐释，本文通过建立APE大鼠模型，对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:清洁级SD大鼠，无锡珊瑚礁生物科技有限公司，许可证号为SCXK(苏)2017-0009，雄性，体重200～240 g。在本院动物房中饲养，温度25℃，相对湿度50%，12 h/12 h交替照明，保证室内环境达到清洁级，且安静、通风良好，具体按照《关于善待实验动物的指导性意见》进行饲养，1周后进行实验。

1.1.2 试剂与仪器:速碧林(低分子肝素钙注射液，规格0.6 ml)，葛兰素史克有限公司；阿托伐他汀钙片(规格10 mg)，辉瑞制药有限公司；大鼠IL-18 ELISA试剂盒、大鼠IL-6 ELISA试剂盒、兔源Anti-GAPDH、Anti-SIRT2、Anti-NF-κB、Anti-PCNA一抗、羊抗兔二抗—货号ab206386、ab100772、ab100768、ab115681、ab38515、ab18197、ab86299，美国Abcam公司；HE染色试剂盒—货号RS3390，北京金克隆生物技术有限公司；BCA试剂盒、蛋白裂解液—货号P0011、P0013B，上海碧云天公司等。DHX-300动物呼吸机：成都仪器厂，中国；ABL80血气分析仪：雷度米特公司，丹麦；2.7F微导管：泰尔茂株式会社，日本；YP100压力换能器：上海益联医学仪器发展有限公司，中国；PowerLab多导生理记录仪：上海然哲仪器设备有限公司，中国；Elx800酶标仪、1658033小型蛋白垂直电泳转印系统：Bio-Rad公司，美国；RM2035轮转切片机：Leica公司，德国；SMZ745光学显微镜：尼康公司，日本；GelSMART凝胶成像仪：北京大龙兴创实验仪器有限公司，中国。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备及分组给药:参照文献[9]制备APE大鼠模型：经SD大鼠尾静脉取血约1 ml，静置使其凝固，置于70℃水浴锅内，加热10 min后，倒入平皿中，将凝固的血液切为小血栓颗粒，直径约0.5 mm，以2.5%戊巴比妥钠溶液腹腔注射，麻醉大鼠，剂量为45 mg/kg，颈部备皮、消毒，分离右颈静脉，以5 ml注射器吸取剪好的血栓27～30个及1 ml 0.9%氯化钠溶液，排除气泡后，刺入颈静脉，循静脉回流方向缓慢推注血栓，用时约5 min，然后缝合伤口，消毒，4 h后，采用改良右心导管法测量大鼠肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心室压力(right ventricular pressure，RVP)，当其明显升高，且大鼠呼吸加深加快、两肺出现弥漫性干湿啰音等症状时，表明建模成功。共建模64只，成功60只，随机分为假手术组、阿托伐他汀低剂量组(1 mg/kg)、阿托伐他汀中剂量组(2 mg/kg)、阿托伐他汀高剂量组(4 mg/kg)、速碧林组(0.01 ml/kg)，每组12只，另取12只SD大鼠分离右颈静脉后不输注血栓，只输入1 ml 0.9%氯化钠溶液，其他操作相同，设定为假手术组。参照文献，以0.9%氯化钠溶液溶解阿托伐他汀钙片[10]，制备为0.1、0.2、0.4 mg/ml的溶液，阿托伐他汀各剂量组以10 ml/kg的剂量灌胃，速碧林组以0.01 ml/kg的剂量皮下注射低分子肝素钙注射液[11]，假手术组及模型组大鼠皮下注射等剂量0.9%氯化钠溶液，同时以10 ml/kg 的剂量灌胃，1次/d，持续14 d。

1.2.2 大鼠mPAP和RVP测定:末次给药结束24 h后，将2.7F微导管经肺动脉、右心房插入右心室，连接压力换能器，测定大鼠mPAP和RVP。

1.2.3 标本采集:大鼠mPAP、RVP测定结束后，参照1.2.1中的方法麻醉大鼠，开胸，钝性分离气管和股动脉，经股动脉取血2 ml备用；剪断股动脉放血，以2 ml注射器刺入气管下段，向其中缓慢注入1ml 0.9%氯化钠溶液，当左肺膨隆，并变苍白时，缓慢回抽，然后再次缓慢注入后回抽，重复3次，所得液体离心5 min(4℃，3 000 r/min)，收集上清，可得肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)，储存在-80℃备用；解剖取出双肺，剪取约0.5 g肺组织，储存于液氮中备用；其余肺组织以生理盐水漂洗、4%多聚甲醛溶液固定、梯度乙醇溶液(由低到高)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，以切片机做连续病理切片备用，厚度为5 μm。

1.2.4 大鼠动脉血气指标测定:采用全自动血气分析仪检测1.2.2中的股动脉血中血气指标：氧分压(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、二氧化碳分压(arterialpartial pressure of carbon dioxide，PaCO2)，具体操作步骤参照其说明书进行。

1.2.5 大鼠肺部病理形态检测:选取1.2.2中完好、典型的切片，进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇(从高到低)浸泡处理，参照试剂盒说明书的步骤进行HE染色，以蒸馏水漂洗后，再次脱水、透明，采用中性树胶封片，使用光学显微镜观察大鼠肺部病理形态，每个切片随机选取5个视野拍照。

1.2.6 大鼠BALF中IL-18、IL-6含量测定：中BALF放置在冰水浴中，缓慢解冻，参照ELISA试剂盒说明书中的操作步骤，测定其中IL-18、IL-6含量。

1.2.7 大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白表达检测:取出1.2.2中肺组织，剪碎后置于含有1 ml蛋白裂解液的干净试管中，以匀浆机制备为匀浆液，离心20 min(4℃，3 000 r/min)，收集上清液，得蛋白样品液，以BCA法测定其中总蛋白浓度，具体步骤参照试剂盒说明书进行，煮沸5 min变性，各组分别取含20 μg 总蛋白的样品液上样，电泳分离蛋白，湿转转移全部分离蛋白至PVDF膜上，然后以5%的脱脂奶粉室温孵育2 h，进行封闭处理，根据蛋白分子量截取目的蛋白条带，放置在小盒中，做好标记，分别加入兔源Anti-GAPDH、Anti-SIRT2、Anti-NF-κB、Anti-PCNA一抗溶液，稀释比例分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000，4℃冰箱中孵育过夜，TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗溶液，稀释比例为1∶2 000，室温孵育2 h，TBST再次漂洗3次，以增强化学发光法显色，使用凝胶成像仪对蛋白条带拍照，以Image-J软件分析图像，获得各组蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对大鼠mPAP和RVP的影响 与假手术组相比，模型组大鼠mPAP、RVP明显增高(P<0.05)；与模型组相比，阿托伐他汀低、中、高剂量组及速碧林组大鼠mPAP、RVP降低(P<0.05)，且阿托伐他汀各组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；阿托伐他汀高剂量组与速碧林组相比，大鼠mPAP、RVP差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 6组大鼠mPAP、RVP比较

2.2 阿托伐他汀处理对大鼠动脉血气相关指标的影响 与假手术组相比，模型组大鼠PaCO2明显增高(P<0.05)，PaO2明显降低(P<0.05)；与模型组相比，阿托伐他汀低、中、高剂量组及速碧林组大鼠PaCO2降低(P<0.05)，PaO2增高(P<0.05)，且阿托伐他汀各组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；阿托伐他汀高剂量组与速碧林组相比，大鼠PaCO2、PaO2差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 6组大鼠动脉血气相关指标比较

2.3 阿托伐他汀对大鼠肺组织病理形态的影响 假手术组肺泡结构完整清晰，肺泡间隔未见炎症细胞浸润，肺血管结构正常；模型组大鼠肺组织呈现肺泡结构损环，间隔充血水肿，炎性细胞浸润明显，肺血管管腔变窄，动脉内膜明显增生等病理损伤，阿托伐他汀低、中、高剂量组及速碧林组大鼠上述肺组织病理损伤减轻，且病理损伤随阿托伐他汀剂量升高而逐次减轻；阿托伐他汀高剂量组与速碧林组相比，大鼠肺组织病理损伤程度无明显差异。见图1。

2.4 阿托伐他汀对大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阿托伐他汀低、中、高剂量组及速碧林组大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且阿托伐他汀各组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；阿托伐他汀高剂量组与速碧林组相比，大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.5 阿托伐他汀对大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白表达的影响 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白SIRT2表达水平明显降低(P<0.05)，核内NF-κB表达水平明显增高(P<0.05)；与模型组相比，阿托伐他汀低、中、高剂量组及速碧林组大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白SIRT2表达水平增高(P<0.05)，核内NF-κB表达水平降低(P<0.05)，且阿托伐他汀各组之间呈剂量依赖性(P<0.05)；阿托伐他汀高剂量组与速碧林组相比，各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图2。

图2 免疫印迹检测各组大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白表达;A 假手术组；B 模型组；C 阿托伐他汀低剂量组；D 阿托伐他汀中剂量组；E 阿托伐他汀高剂量组；F 速碧林组

表4 6组大鼠肺组织SIRT2/NF-κB通路相关蛋白相对表达

3 讨论

近年来，我国APE的发病率逐年升高，严重危害人民群众身心健康，因肺部血流循环障碍，APE患者可产生肺动脉高压、肺血管内膜增生、肺不张、气体交换障碍、低氧血症一系列病理症状，其中缺血缺氧引发的肺部炎性反应是主要的致病基础[12-14]。本文以自体血栓回输法构建APE大鼠模型，结果显示，建模大鼠肺组织呈现肺泡结构损环，间隔充血水肿，炎性细胞浸润明显，肺血管管腔变窄，动脉内膜明显增生等病理损伤，肺部mPAP、RVP、动脉血PaCO2、BALF中IL-18及IL-6水平明显升高，动脉血PaO2明显降低，表明血栓回输后，大鼠肺血管栓塞后，大鼠肺动脉压和右心室压力明显升高，促炎因子IL-18、IL-6大量表达合成，引发严重的炎性反应，造成肺组织损伤及肺血管增生，导致肺脏换气功能障碍，使动脉血中CO2潴留，O2减少，揭示模型建立成功。

APE常用的治疗方法是溶栓、抗凝，低分子肝素能降低凝血因子Ⅹa的活性，抑制血栓形成，是治疗APE的临床常用抗凝药物，可作为研究APE的阳性对照药[15]。阿托伐他汀作为临床常用的降脂药，具有明显的抗氧化、抗炎作用，可通过降低氧化应激水平，抑制炎性反应过程来减轻乙醇诱导的肝毒性，并可减小脑梗死体积，减轻APE导致的肺损伤，改善肺功能[8,16-18]。本文结果显示，与模型组相比，阿托伐他汀低、中、高剂量组大鼠肺组织病理损伤减轻，大鼠mPAP、RVP、动脉血PaCO2、BALF中IL-18及IL-6水平降低，动脉血PaO2升高，且阿托伐他汀各组之间呈剂量依赖性，表明阿托伐他汀可降低促炎因子合成分泌，抑制炎性反应，降低肺动脉压和右心室压，减轻肺组织损伤，缓解肺血管内膜增生，改善肺脏换气功能，进一步证实阿托伐他汀对APE具有治疗作用。

SIRT2/NF-κB作为机体调节炎性反应的主要信号，在APE的发生发展过程中起到重要的调控作用。在APE的病理反应过程中，SIRT2表达受到抑制，降低NF-κB蛋白的去乙酰化水平，增强其向细胞核内的转移，促使炎症进展，加重了肺部损伤；通过上调SIRT2表达，可增强NF-κB蛋白的去乙酰化，抑制其核转移，进而抑制炎症的发生发展，减轻APE引发的肺损伤[4,19,20]。本文结果显示，APE模型大鼠肺组织SIRT2蛋白表达明显降低，核内NF-κB蛋白表达明显升高，经阿托伐他汀治疗后，大鼠肺组织SIRT2蛋白表达升高，核内NF-κB蛋白表达降低，表明SIRT2/NF-κB参与介导APE大鼠的肺组织损伤过程，阿托伐他汀可上调SIRT2表达，抑制NF-κB蛋白的核转移，缓解肺组织损伤，改善APE大鼠的动脉血气指标，减轻其临床症状。

综上所述，阿托伐他汀可激活SIRT2信号，降低NF-κB蛋白核转移，阻止炎症发生发展，降低肺动脉压及右心室压力，减轻肺部病理损伤，恢复肺泡正常换气功能，提高动脉血中氧气含量，减少CO2潴留，改善APE临床症状。上调SIRT2表达，抑制NF-κB信号激活可能是阿托伐他汀治疗APE的药理机制之一，后续还需通过上调及下调SIRT2表达来进行对照验证。