某院肺炎克雷伯菌分布及其耐药性与携带毒力基因种数的关系

吴 乾

江苏省常州市中医医院检验科，江苏常州 213000

肺炎克雷伯菌是医院感染常见的病原菌之一，主要分布在上呼吸道、肠道等部位，当机体抵抗力下降时其可经上呼吸道进入到肺内导致肺实质病变，引起大叶性肺炎或小叶性肺炎[1-2]。近年来，临床上抗菌药物的大量应用导致人体呼吸道菌群改变，肺炎克雷伯菌的耐药性逐年升高。2015年全国细菌耐药监测报告显示，肺炎克雷伯菌对头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药物的耐药率分别为36.5%、7.6%[3]。但是不同地区肺炎克雷伯菌的分布和耐药性存在差异，因此，本研究探讨了本院肺炎克雷伯菌的分布情况及其耐药性与携带毒力基因种数的关系，以期为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选择2017年1月至2020年1月本院分离的肺炎克雷伯菌190株为研究对象，同一患者同类型标本分离到的同一菌株不重复计入。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2菌株鉴定和药敏试验 分离出的菌株使用美国BD公司生产的Phoenix 100全自动细菌鉴定仪进行鉴定。使用美国临床和实验室标准协会(CLSI)2014年发布的相关标准进行结果判读，使用抗菌药物体外敏感的药敏纸片进行头孢唑啉、头孢噻肟、复方磺胺甲噁唑、庆大霉素、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、哌拉西林、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、阿米卡星及亚胺培南的药敏试验。

1.3毒力基因检测 首先制备DNA模板，采用水煮法，99 ℃煮10 min，然后以12 000 r/min离心5 min，收集上清液作为PCR模板。PCR反应体系：2.5 μL 10×PCR缓冲液,上下游引物各0.5 μL,2.0 μL DNA基因组模板,1.0 μL Tap聚合酶，采用ddH2O定容至25.0 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2及wcaG基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增试剂由日本Takara公司提供,使用PCR检测上述基因。

1.4统计学处理 采用WHONET5.6分析药敏试验结果，采用SPSS18.0进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肺炎克雷伯菌的分布情况 190株肺炎克雷伯菌中，来自男性患者112株，女性患者78株；患者年龄13～77岁，平均(45.2±6.9)岁。来自呼吸系统感染患者133株(70.00%)，消化系统感染患者17株(8.95%)，肿瘤患者40株(21.05%)。99株(52.11%)来自痰液标本，53株(27.89%)来自脓肿穿刺液或脓性分泌物标本，16株(8.42%)来自腹水标本，10株(5.26%)来自血液标本，12株(6.32%)来自尿液标本。

2.2肺炎克雷伯菌的耐药性 190株肺炎克雷伯菌中，有46株(24.21%)为产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株，144株(75.79%)为非产ESBLs菌株。肺炎克雷伯菌对哌拉西林、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松的耐药率较高，分别为43.68%、37.89%、32.63%、33.68%、32.63%，对头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率较低，分别为6.84%、4.21%、1.58%、11.05%。肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松、哌拉西林的耐药率达100.00%，见表1。

表1 肺炎克雷伯菌的耐药率分布[n(%)]

2.3肺炎克雷伯菌的毒力基因分布情况 毒力基因aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2、wcaG的检出率分别为54.74%、48.95%、15.79%、53.16%、51.58%、21.05%。肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株和非产ESBLs菌株的毒力基因检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。携带1种毒力基因的菌株占24.74%，携带6种毒力基因的菌株占13.16%，肺炎克雷伯菌毒力基因携带情况见表3。

表2 肺炎克雷伯菌的毒力基因分布情况[n(%)]

表3 肺炎克雷伯菌的毒力基因携带情况(n=190)

2.4毒力基因与耐药性间的关系 分析肺炎克雷伯菌携带毒力基因种数(“0～6”分别表示菌株检出0～6种毒力基因)与耐药药物种数(“0～15”分别表示对0～15种药物耐药)的相关性，结果显示，携带毒力基因种数与耐药药物种数呈负相关(r=-0.869，P<0.05)。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染常见的病原菌之一，有较高的多重耐药和交叉耐药性，是导致患者住院时间延长、病死率增高的重要原因[4-6]，因此,研究肺炎克雷伯菌的分布特点及其耐药性对临床诊治工作具有重要的指导意义。

本研究分离出的190株肺炎克雷伯菌中，来自呼吸系统感染患者的占70.00%；来自痰液标本的占52.11%，提示肺炎克雷伯菌主要引起呼吸道感染，对呼吸道感染患者进行痰液标本检测十分必要。此外，本研究从腹水标本中分离出16株(8.42%)肺炎克雷伯菌，从血液标本中分离出10株(5.26%)肺炎克雷伯菌，提示肺炎克雷伯菌还可能导致血流感染及腹腔感染，虽然检出率不高，但临床也应重视对腹水、血液标本的检测。

本研究中，产ESBLs菌株的检出率为24.21%。肺炎克雷伯菌的多重耐药可能与产ESBLs有关[7]。产ESBLs是肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗菌药物多重耐药的重要机制，ESBLs不仅可以分解第1、2、3代头孢菌素及广谱青霉素，还可分解第4代头孢菌素，对喹诺酮类、氨基糖苷类发生交叉耐药[8]。本研究发现，肺炎克雷伯菌对哌拉西林、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松的耐药率较高，分别为43.68%、37.89%、32.63%、33.68%、32.63%，对亚胺培南的耐药率最低，为1.58%，说明肺炎克雷伯菌对哌拉西林和头孢菌素类抗菌药物有较高的耐药性，对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南的耐药性较低，主要是因为碳青霉烯类抗菌药物是一种广谱抗菌药物，对头孢菌素酶或ESBLs的作用较稳定，有持续抗菌后效应，是治疗革兰阴性菌感染的一线药物，但是有研究表明随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，其耐药性也在不断增加[8]。此外，本研究分离的肺炎克雷伯菌对头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星的耐药率也较低，分别为6.84%、4.21%。建议临床在选用抗菌药物时尽量根据药敏试验结果进行选择，避免大量使用碳青霉烯类抗菌药物，以免造成抗菌药物滥用及多重耐药菌的产生。

肺炎克雷伯菌含有一些毒力基因，可以编码一些蛋白质，参与肺炎克雷伯菌的侵袭、定植、黏附及抗吞噬等过程[7]。本研究结果显示，肺炎克雷伯菌毒力基因aer-1、rmpA、magA、ybt、gyrB-2、wcaG的检出率分别为54.74%、48.95%、15.79%、53.16%、51.58%、21.05%，并且产ESBLs菌株和非产ESBLs菌株的毒力基因检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。magA可以编码一种外膜蛋白，该蛋白与肺炎克雷伯菌形成荚膜多糖有关，并且magA表达可引起转移性脓毒症、原发性肝脓肿等[9]。rmpA表达可以控制类黏蛋白表型和荚膜黏多糖的产生，与肺炎克雷伯菌的抗吞噬作用有较大关系。ybt表达可使肺炎克雷伯菌在呼吸道定植，并且可降低脂质运载蛋白2水平，导致肺炎[10-11]。在本研究中，肺炎克雷伯菌毒力基因的检出率较高，且存在携带多种毒力基因的情况。肺炎克雷伯菌的致病性与毒力、耐药性有关[12]，本研究发现，肺炎克雷伯菌携带毒力基因种数与耐药药物种数呈负相关(r=-0.869，P<0.05)，说明携带毒力基因种数越多的菌株，耐药药物的种数越少，即发生多重耐药性的概率越小。

综上所述，肺炎克雷伯菌主要引起呼吸道感染，对头孢菌素类、哌拉西林等抗菌药物的耐药率较高。肺炎克雷伯菌中毒力基因aer-1、rmpA、ybt、gyrB-2的检出率较高，且携带毒力基因种数越多，对抗菌药物可能越敏感。