双酚A和邻苯二甲酸二丁酯暴露对雌性幼鼠青春期发育的影响*

罗小娟，曹 科△，叶炳均，陶明俊，陈小文，张 琴，陈运生

广东省深圳市儿童医院:1.检验科;2.儿科研究所;3.内分泌科,广东深圳 518038

近年来，女童性早熟发病率呈明显上升趋势，从人体血液、尿液等标本中检出的双酚A(BPA)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)等环境内分泌干扰物(EEDCs)对女童青春期发育和内分泌的干扰作用，以及对生殖系统的毒性机制，引起公众和学术界的广泛关注。目前，研究认为EEDCs可通过受体和非受体介导途径模拟或拮抗内源性激素，并可干扰内源性激素的生物合成、分泌、转运、结合、反应和代谢等过程，从而对生物个体的生殖、神经和免疫系统等的功能产生影响，引起可逆或不可逆的生物学效应。BPA和DBP在人类生活环境中广泛存在，是具有一定代表性的EEDCs。本研究以处于青春期启动前关键时期的雌性幼鼠(生后第21天) 作为研究对象，通过灌胃的给药方式制备动物研究模型，探讨BPA和DBP是否可导致雌性幼鼠青春期启动提前，其机制是否与下丘脑-垂体-性腺轴和Kisspeptin-KISS-1/G蛋白偶联受体54(GPR54)-促性腺激素释放激素(GnRH)信号系统相关，以明确BPA和DBP对雌性幼鼠青春期发育的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料来源 经检疫合格的1日龄清洁级SD雌性幼鼠14窝(共153只)，购自广东省医学实验动物中心(实验动物质量合格证明编号：440072000 25061)，在无特定病原体(SPF)级饲养室饲养，饲养室温度、湿度等条件保持稳定，自由进食饮水，整个实验过程均用不含大豆异黄酮等植物雌激素的饲料喂养，饲料配方为玉米淀粉32.0%，蔗糖30.0%，酪蛋白23.0%，纤维素5.0%，玉米油5.0%，93G混合矿物质3.5%，93G混合维生素1.0%，蛋氨酸0.3%，氯化胆碱0.2%，饲料质量合格证编号：No.44200300007449。幼鼠于21日龄称取体质量，留取64只，用随机数字表法分成8组，分别为BPA干预组、DBP干预组、BPA+DBP干预组、雌二醇(E2)组、BPA空白对照组、DBP空白对照组、正常对照组、溶剂组，每组8只，各组采用不同的处理方法。

1.2仪器与试剂 BPA、DBP(分析纯99%)购于美国Sigma公司；玉米油(溶剂)购于益海嘉里投资有限公司；血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、E2和Kisspeptin酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购于上海心语生物科技有限公司；酶标分析仪购于深圳市汇松科技发展有限公司；总RNA提取试剂盒购于广州洪祥生物医药科技有限公司；合成cDNA和PCR反应试剂盒购于日本Takara公司；ABI 7900HT 荧光定量PCR仪购于美国赛默飞世尔公司；KISS-1、GPR54、雌激素受体(ER)α、ERβ引物由美国Invitrogen公司合成；其他生化试剂及耗材等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3方法

1.3.1各组干预方法 (1)BPA干预组：BPA溶液每天灌胃1次,剂量为0.25 mg/kg，连续干预10 d，于幼鼠阴道开口当天处死；(2)DBP干预组：DBP溶液每天灌胃1次，剂量为50 mg/kg，连续干预10 d，于幼鼠阴道开口当天处死；(3)BPA+DBP干预组：0.20 mg/kg BPA溶液+40 mg/kg DBP溶液每天灌胃1次，连续干预10 d，于幼鼠阴道开口当天处死；(4)E2组：E2溶液每天灌胃1次，剂量为0.1 mg/kg，连续干预10 d，以其作为阳性对照，于幼鼠阴道开口当天处死；(5)BPA空白对照组：每天给予10 mL/kg的不含BPA的玉米油溶液灌胃1次，处死BPA干预组时等比例处死；(6)DBP空白对照组：每天给予10 mL/kg的不含DBP的玉米油溶液灌胃1次，处死DBP干预组时等比例处死；(7)正常对照组：只观察不干预，于幼鼠阴道开口当天处死；(8)溶剂组：因为除正常对照组外，其余各组均以玉米油为溶剂，为排除玉米油对雌性幼鼠发育的影响，本研究特设溶剂组，每天给予10 mL/kg玉米油溶液连续灌胃10 d，于幼鼠阴道开口当天处死。采用被毛染色法，在幼鼠体表不同部位的被毛涂染斑点，根据染色情况和笼具双重编号标记识别。每天称取幼鼠体质量，并根据体质量调整药物剂量。观察并记录幼鼠阴道开口时间(VOD)，处死时采用心脏穿刺采血，离心留取血清，留取卵巢、下丘脑组织置于-70 ℃以下冰箱保存。同时取部分子宫和卵巢组织置于4%多聚甲醛溶液中保存，用于组织形态观察。

1.3.2检测方法 采用ELISA检测FSH、LH、E2和Kisspeptin水平，按照试剂盒说明书步骤操作。取卵巢和子宫垂直横断面，常规石蜡包埋，切片，染色，光学显微镜下观察各组幼鼠卵巢和子宫组织形态。提取下丘脑和卵巢组织总RNA，将RNA反转录为cDNA。根据SYBRGreen Real-Time PCR Master Mix试剂盒说明书，检测下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA，卵巢ERα、ERβ mRNA和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达情况。相关引物序列见表1。

2 结 果

2.1各组基本资料比较 与正常对照组和溶剂组相比，BPA干预组和E2组VOD提前，差异有统计学意义(P<0.05)。各组第1次给药前体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；BPA干预组、BPA空白对照组和E2组处死时体质量低于其余各组，差异有统计学意义(P<0.05)，但BPA干预组和BPA空白对照组处死时体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。溶剂组与正常对照组VOD、处死时体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 引物序列

表2 各组基本资料比较

2.2各组血清性激素水平比较 BPA干预组血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平明显高于BPA空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且BPA干预组LH/FSH>1，提示性发育已启动。BPA干预组血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平与正常对照组和溶剂组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。E2组血清LH、FSH和Kisspeptin水平明显低于正常对照组和溶剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。溶剂组与正常对照组血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组血清性激素水平比较

2.3子宫、卵巢组织病理学检查结果 BPA空白对照组幼鼠卵巢皮质可见各级卵泡，以原始卵泡及生长卵泡居多，未见黄体；子宫体积较小，黏膜上皮排列整齐，可见少量腺体，见图1～2。BPA干预组幼鼠卵巢皮质可见大量生长卵泡，少量闭锁卵泡、成熟卵泡及黄体；子宫体积增大，子宫壁增厚，腺体增多，幼鼠性发育提前，见图3～4。溶剂组和正常对照组幼鼠子宫内膜及腺体、卵巢内各级卵泡数量和形态大致正常，见图5～6。与溶剂组和正常对照组相比，E2组幼鼠在出现阴道开口时，子宫内膜厚度和腺体发育成熟度，以及卵巢内卵泡数量和黄体发育程度明显降低，见图7～8。BPA干预组、DBP干预组、BPA+DBP干预组幼鼠子宫内膜及腺体、卵巢内各级卵泡数量和形态均未见明显病理学改变。

图1 BPA空白对照组幼鼠卵巢组织HE染色图片(×40)

图2 BPA空白对照组幼鼠子宫组织HE染色图片(×100)

图3 BPA干预组幼鼠卵巢组织HE染色图片(×40)

图4 BPA干预组幼鼠子宫组织HE染色图片(×100)

图5 溶剂组幼鼠卵巢组织HE染色图片(×40)

图6 溶剂组幼鼠子宫组织HE染色图片(×100)

图7 E2组幼鼠卵巢组织HE染色图片(×40)

图8 E2组幼鼠子宫组织HE染色图片(×100)

2.4各组下丘脑KISS-1、GPR54和卵巢ERα和 ERβ mRNA表达水平比较 BPA干预组下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA表达水平明显高于BPA空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；BPA干预组下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA表达水平与正常对照组和溶剂组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。E2组下丘脑KISS-1和卵巢ERβ mRNA表达水平明显低于正常对照组和溶剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组下丘脑KISS-1、GPR54和卵巢ERα、ERβ mRNA表达水平比较

3 讨 论

个体青春期发育和性启动过程受遗传基因、营养代谢和生活环境等多因素调控[1-2]，近年来，生存环境中广泛存在的痕量持久性有机物和EEDCs备受关注[3-4]，其中，BPA和DBP是世界上产量位于前列的有机化工原料，广泛存在于人类生活环境和日常用品中，具有类雌激素样干扰作用和内分泌生殖毒性，且存在低剂量效应和联合作用[5-8]。以文献[9-11]为主要参考依据，本研究分别选择BPA 0.25 mg/kg，DBP 50 mg/kg，BPA 0.20 mg/kg+DBP 40 mg/kg为干预剂量，上述剂量为在人群日常暴露范围内，生殖毒性实验研究中较低的剂量。美国以每日接触量≤0.05 mg/kg作为人类BPA暴露的“安全剂量”，按照等效药物剂量换算，实验鼠药物剂量约为人类的5倍，即0.25 mg/kg[12]。本研究结果显示，0.25 mg/kg BPA可致处于青春期启动前关键时期的雌性幼鼠VOD提前，导致雌性幼鼠性早熟，与WANG等[13]的研究结果一致，值得引起重视。但是目前BPA引起性早熟的有效剂量范围和剂量效应关系有待进一步研究。DBP 50 mg/kg、联合干预(BPA 0.20 mg/kg+DBP 40 mg/kg)均未引起VOD提前，可能与其剂量有关，且二者联合在生物体内存在相互拮抗而非协同作用。研究报道，EEDCs存在“U”效应现象，即在一定的剂量范围内，剂量-效应曲线的斜率发生正负转换[14-15]。不同组合的EEDCs，其联合效应也可随剂量改变发生协同或拮抗双向改变。

青春期性发育由下丘脑-垂体-性腺轴的启动激活引起，由基因KISS-1编码的神经递质Kisspeptin是下丘脑GnRH最重要的调控因子，Kisspeptin与内源性受体蛋白GPR54结合后能刺激GnRH的释放，并且其促性腺激素效应的基本位点是在下丘脑GnRH神经元内，且该效应是唯一通过GPR54介导表达实现的[16]。下丘脑Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信号系统的激活，ER表达增加并反馈调节GnRH神经元，性激素LH、FSH水平随之升高，进而作用于性腺靶器官，启动青春期发育。阴道开口是雌性幼鼠性发育启动的外在标志，是判断青春期发育启动的重要标准。本研究结果显示，0.25 mg/kg BPA可引起雌性幼鼠VOD提前，BPA干预组血清LH、FSH、LH/FSH、E2、Kisspeptin水平，下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA表达水平明显高于BPA空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，BPA的毒性机制可能涉及下丘脑Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信号传导和下丘脑-垂体-性腺轴提前激活，中枢性关键基因KISS-1和蛋白Kisspeptin提前表达，导致青春期发育启动和性发育提前(性早熟)。但BPA干预组下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA表达水平，血清Kisspeptin、性激素水平与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示BPA干预并未破坏雌性幼鼠青春期发育启动的中枢性关键环节Kisspeptin-KISS-1/GPR54信号系统，其下丘脑-垂体-性腺轴启动过程和效应并未发生明显改变，推测BPA暴露引起VOD提前并不是直接通过改变KISS-1基因表达来实现[17]，可能与其上游调控因子或GnRH相关抑制因素破坏相关，提示青春期启动涉及兴奋和抑制双向有序调节的多基因功能网络系统，其确切机制有待进一步实验验证。

本研究将E2暴露作为雌性幼鼠VOD提前和卵巢发育异常的阳性对照[17]。结果显示，E2组VOD提前，但与BPA干预组不同的是，E2组雌性幼鼠在出现阴道开口时，其下丘脑KISS-1和卵巢ERβ mRNA表达水平，血清LH、FSH和Kisspeptin水平，子宫内膜厚度和腺体发育成熟度，以及卵巢内卵泡数量和黄体发育程度均明显低于正常对照组和溶剂组。以上结果表明高水平的E2暴露可对处于青春期启动前关键时期的雌性幼鼠下丘脑、子宫、卵巢发育造成严重影响，推测其可能机制与E2暴露导致雌性幼鼠下丘脑KISS-1基因神经元应对性激素正反馈通路破坏有关；也可能是通过性腺、类固醇代谢、转运蛋白或受体途径干扰内源性类固醇生成，高水平E2通过负反馈调控机制抑制下丘脑GnRH分泌，甚至破坏GnRH脉冲发生器的正常功能，从而使LH和FSH的正常分泌受到影响，干扰和破坏下丘脑-垂体-性腺轴的正常功能。溶剂组VOD、第1次给药前体质量、处死时体质量、性激素水平，下丘脑KISS-1、GPR54和卵巢ERα、 ERβ mRNA表达水平与正常对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，可基本排除溶剂本身对幼鼠青春期发育和性腺器官的影响。

综上所述，BPA暴露可致雌性幼鼠性早熟，其致病机制可能与下丘脑Kisspeptin-KISS-1/GPR54-GnRH信号传导和下丘脑-垂体-性腺轴提前激活有关，但尚需进一步对剂量效应关系，以及其确切的分子生物学和表观遗传学致病机制进行深入探讨，以避免EEDCs对女童性早熟等生长发育的干扰和生殖毒性危害。