L-4F对小鼠胰腺癌的抑制作用

黄文敬，刘海辰，周建宇

1.天津市红桥区邵公庄街社区卫生服务中心检验科，天津 300121；2.天津市公安医院检验科，天津 300120；3.协和干细胞基因工程有限公司，天津 300384

胰腺癌是具有极强侵袭性的恶性肿瘤,近年来,我国胰腺癌的发病率呈上升趋势,其发病率和病死率分别位于恶性肿瘤的第9位和第6位。手术切除是目前唯一能根治胰腺癌的方法,但有手术机会的患者仅占10%～20%,即使是可进行手术的患者术后5年生存率也不足20%[1]。胰腺导管腺癌家族史和慢性胰腺炎是胰腺癌的两大危险因素[2]。炎症也可通过促进上皮细胞向间充质细胞转化和促进肿瘤细胞进入血液循环而加速胰腺癌的发展，因此，抗炎药物治疗在抑制胰腺癌扩散方面具有一定作用。已有研究证实，载脂蛋白A-I模拟肽L-4F是一种有效的抗氧化、抗炎剂[3]。基于此，本研究对L-4F在小鼠胰腺癌模型中的作用进行了探讨，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体质量16～20 g，共16只(购自北京军事医学科学院)，编号采用耳朵打孔的方式。饲养条件：无菌，25 ℃恒温，光照/黑暗12 h循环，食物与水按时投喂。饲养地点：天津医科大学动物实验中心，严格按照天津医科大学动物伦理委员会制定的实验室动物管理与使用条例进行管理、使用。小鼠胰腺癌细胞系H7。

1.2仪器与试剂 主要试剂：L-4F(序列Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2)及其无功能对照Sc-4F (序列Ac-D-W-F-A-K-D-Y-F-K-K-A-F-V-E-E-F-A-K-NH2)由Lysine Bio-System公司合成；胎牛血清、DMEM培养液、L-谷氨酰胺、双抗青霉素-链霉素、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海索来宝生物科技有限公司。主要仪器：倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；超净工作台购自苏州苏净安泰空气技术有限公司；细胞培养板、细胞培养皿，一次性5 mL、10 mL吸管及一次性15 mL、50 mL离心管购自美国Corning公司；CO2培养箱购自日本三洋公司；Eppendorf 5804高速离心机、迷你离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1试剂配制 将L-4F及其无功能对照Sc-4F 溶解于50 mmol/L碳酸氢铵(pH值为7.0)及0.1 mg/mL Tween-20中备用。

1.3.2细胞培养 具有高迁移能力的胰腺癌H7细胞参照文献[4-5]的体外筛选实验方法获得。将胰腺癌H7细胞培养于添加了10%胎牛血清、100 mg/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养液中，然后放入5% CO2、37 ℃的培养箱内培养。

1.3.3胰腺癌原位荷瘤小鼠模型的构建 细胞准备：接种胰腺癌H7细胞在10 cm细胞培养皿内，采用DMEM培养液(含10%胎牛血清，1%的双抗青霉素-链霉素)在37 ℃、5% CO2条件下培养，达到对数生长期后开始收获细胞。胰酶收获细胞：在每个10 cm细胞培养皿中加入1 mL 0.25%的胰酶，消化1 min,加入含10%胎牛血清的2 mL DMEM培养液，终止胰酶消化，转入15 mL离心管,加入5 mL PBS，冲洗培养皿，转入15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清,用PBS重悬H7细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复冲洗2次。细胞计数：收集的H7细胞用PBS重悬，计数，并调整细胞终水平至2×107/mL。麻醉小鼠：每只小鼠腹腔注射麻醉剂苯戊巴比妥(剂量为150～200 μL)，注射前用75%乙醇对小鼠注射部位进行消毒。胰腺癌H7细胞注射：麻醉后用棉签蘸取聚维酮碘消毒液对小鼠腹部消毒；在小鼠左上腹部用眼科手术剪做一长约1 cm的纵切口，用无菌棉签轻轻翻找，使脾脏可见，然后在脾脏附近寻找胰腺；确定胰腺后，用眼科弯镊子轻轻夹住胰腺尾部尖端和脾脏，并轻轻横向拉出使胰腺充分暴露(注意切勿弄破脾脏)；选用27-gauge规格的注射器针头，用规格1 mL的注射器轻轻从胰腺尾部尖端开始，沿横轴插到胰腺头部区域后固定(注意切勿穿透胰腺，否则胰液外漏可能导致小鼠死亡)，然后每只小鼠注射2×107/mL的H7细胞50 μL(注意细胞注射成功可见一明显小水泡鼓起，若胰腺被穿破，则注射时可见细胞悬浮液外漏；进针后或出针前稍改变针头方向，缓慢注入细胞悬液，缓慢出针，用无菌棉签轻按针孔片刻可有效避免漏液)。轻轻将脾脏和胰腺送回腹腔，小鼠的皮肤和腹膜用规格为3-0的外科手术线缝合。手术结束后，小鼠放在白炽灯照射加热的温暖环境中，直到自然苏醒。L-4F及Sc-4F处理：术后第3天，将胰腺癌原位荷瘤小鼠随机分为L-4F组与Sc-4F组，每组8只，分别接受L-4F(10 mg/kg)及其无功能对照Sc-4F(10 mg/kg)腹腔注射治疗，每天1次，共治疗7 d。处死小鼠：治疗7 d后，麻醉小鼠，脱颈处死，分离收获小鼠的胰腺肿瘤，观察肿瘤体积大小并称量肿瘤重量。

1.3.4HE染色 收集L-4F组与Sc-4F组胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤组织，石蜡包埋，制作石蜡切片，进行HE染色，观察组织中血管生成、炎性反应情况。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1L-4F处理抑制胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤体积增长 与Sc-4F组小鼠的肿瘤体积比较，L-4F组小鼠肿瘤体积较小。L-4F组与Sc-4F组的胰腺癌分期也明显不同，Sc-4F组大多数小鼠显示出胰腺癌终末期常见的临床表现，如腹水、远处转移和肠系膜淋巴结肿大，而L-4F组小鼠上述临床表现较少。见图1。

图1 Sc-4F组和L-4F组典型胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤

2.2L-4F处理抑制胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤重量增长 Sc-4F组小鼠的肿瘤重量高于L-4F组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：Sc-4F组与L-4F组比较，*P<0.05。

2.3L-4F处理抑制胰腺癌原位荷瘤小鼠肿瘤组织中的血管生成 Sc-4F组小鼠肿瘤组织中有大量血管生成，与其相比，L-4F组小鼠肿瘤组织中的血管数量明显减少。见图3。

注：箭头所示为血管。

2.4L-4F处理抑制胰腺癌原位荷瘤小鼠肿瘤组织中的炎性反应 Sc-4F组小鼠的肿瘤组织中炎症细胞大量浸润，与其相比，L-4F组小鼠的肿瘤组织中炎症细胞数量大量减少。见图4。

注：箭头所示为炎症细胞浸润部位。

3 讨 论

胰腺癌是全球公认的最致命的恶性肿瘤之一，其5年总生存率<5%,而接受手术治疗后复发也很常见,根治术后行辅助化疗的患者中位生存期只有20～23个月,这给胰腺癌的治疗提出了更高的要求,需要临床进一步改进胰腺癌管理策略和改善治疗方案[2]。因此，研究者一直在不断努力地开发新型、低毒、有效的抗胰腺癌药物。

载脂蛋白A-I(apoA-I)作为一个很有前景的治疗靶点，已被用于很多疾病的临床研究。除抗动脉粥样硬化的作用以外，apoA-I还具有抗炎、抗氧化应激和抗细胞凋亡等作用。L-4F是apoA-I模拟肽的一种，由18个氨基酸残基组成,因其具有较好的理化特性和较高的生物学活性而被广泛应用于多种疾病动物模型的研究中，如冠心病、糖尿病和关节炎等的相关研究。有研究证实,apoA-I及其模拟肽能够通过减少炎症细胞因子的释放，从而减轻炎性反应[4]。本研究探讨了L-4F在胰腺癌中的抗肿瘤作用，结果表明，与Sc-4F组比较，L-4F组胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤体积和重量均明显减小/降低，且Sc-4F组大多数小鼠出现胰腺癌终末期常见的临床表现，如远处转移、腹水和肠系膜淋巴结肿大等，而L-4F组出现上述临床表现的小鼠很少。通过对胰腺癌原位荷瘤小鼠的肿瘤组织进行石蜡切片HE染色，本研究发现，L-4F处理抑制了肿瘤组织中的血管生成与炎症细胞浸润。上述结果初步证明，L-4F具有抗胰腺癌作用，在接下来的研究中，本课题组将从L-4F对胰腺癌肿瘤微环境的影响方面出发，探讨可能的机制。

已有研究证实，L-4F具有抗氧化、抗炎作用[6]。血红素氧合酶1(HO-1)可能在拮抗高代谢状态导致的炎性反应、内皮损伤及氧化应激中发挥了重要作用[7]。充分上调HO-1表达可以保护组织细胞，对抗氧化应激损伤，其机制可能与经L-4F处理后的HO-1表达上调，同时激活了单磷酸腺苷活化的蛋白激酶与磷酸化蛋白激酶信号通路有关。L-4F与辛伐他汀联合应用能够通过上调相关蛋白的表达促进胆固醇流出，有效减少动脉粥样硬化病变的发生[8]。近期有研究发现，L-4F有较强的抗肿瘤作用，其可通过降低卵巢癌、结肠癌细胞的活性和增殖能力，抑制肿瘤血管的生成，从而抑制卵巢癌、结肠癌的发展[9-11]。L-4F与多种肿瘤的发生发展、药物耐受和预后的相关性已被广泛报道，基础研究亦发现L-4F可能通过抗氧化、免疫调节、结合脂多糖及参与代谢与内分泌等机制来发挥抗肿瘤效应[12]。L-4F在肿瘤早期诊断、治疗和预后判断上的价值值得进一步验证和探索。