肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦的耐药性分析

杨 铭，苏 博，台锦阁，汪定成，邵海连，张霄霄，张 倩，董 轲

空军军医大学第二附属医院检验科，陕西西安 710038

肺炎克雷伯菌是临床常见的引起严重感染的重要病原菌，近年来，其检出率和耐药率逐年增高，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药率由2013年的4.9%上升至2019年的10.9%，使临床抗感染治疗愈加困难[1-2]。新型抗菌药物头孢他啶/阿维巴坦可有效抑制β-内酰胺酶，能用于严重革兰阴性菌感染的治疗[3]，这为临床治疗和控制肺炎克雷伯菌，特别是CRKP引起的严重感染提供了新的途径。本研究通过分析肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦的耐药性，以期为临床抗感染治疗提供实验依据。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选取2018年1月至2020年6月本院检出的肺炎克雷伯菌1 785株为研究对象。

1.2仪器与试剂 头孢他啶(30 μg)/阿维巴坦(20 μg)药敏纸片(英国Oxoid公司)，VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统(法国生物梅里埃公司)，WalkAway 96 Plus全自动细菌鉴定及药敏分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，Thermal cycler型PCR仪(美国ABI公司)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，DYY-8C型稳压稳流定时电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，Mini BIS PRO凝胶成像系统分析仪(以色列DNR公司)。TapDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，琼脂糖(美国Invitrogen公司)，胰蛋白胨、酵母浸出物(英国Oxoid公司)，DL2000 DNA Marker、溴化乙锭(北京鼎国生物技术有限公司)。PCR扩增引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，其余试剂为实验室自行配制。

1.3方法

1.3.1药敏试验 采用WalkAway 96 Plus全自动细菌鉴定及药敏分析仪检测1 785株肺炎克雷伯菌对21种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC) 。对CRKP补充头孢他啶/阿维巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素及多黏菌素B的药敏试验，结果根据美国临床和实验室标准协会(CLSI) 2020版相关标准进行判断。

1.3.2改良碳青霉烯类灭活法(mCIM)和乙二胺四乙酸碳青霉烯类灭活法(eCIM) 对CRKP进行检测，取A、B两支含2 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的试管，B管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混匀，再向A、B管中分别加入1 μL已在血平板上孵育18～24 h的待检细菌，震荡混匀10～15 s。A、B管中分别放入1张含10 μg美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中，35 ℃ 4 h孵育；孵育结束后，用接种环分别将A、B管中的美罗培南纸片取出，贴于同一块已涂布有0.5麦氏浊度大肠埃希菌ATCC 25922的MH琼脂平板上。根据CLSI 2020相关标准进行结果判断。

1.3.3碳青霉烯酶抑制增强试验 将0.5麦氏浊度的CRKP菌悬液均匀涂布于MH琼脂平板上，贴4张亚胺培南纸片，1张纸片不滴加任何液体，1张纸片滴加10 μL氨基乙基二苯硼酸酯(APB)溶液，1张纸片滴加10 μL EDTA溶液(初始浓度0.1 mol/L)，1张纸片同时滴加APB溶液和EDTA溶液各10 μL。过夜孵育，量取抑菌圈直径。结果判读如下：如滴加APB溶液使抑菌圈直径扩大5 mm以上，判断为产A类碳青霉烯酶；如滴加EDTA溶液使抑菌圈直径扩大5 mm以上，判断为产B类碳青霉烯酶；如同时滴加APB和EDTA溶液使抑菌圈直径扩大5 mm以上，则判断为同时产A类和B类碳青霉烯酶。

1.3.4碳青霉烯酶耐药基因检测 对2020年1-6月收集的19株CRKP进行碳青霉烯酶耐药基因检测，参考文献[4-5]设计引物。PCR反应体系为20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物1 μL，DNA模板1 μL，双蒸水8 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环; 最后再72 ℃延伸4 min。扩增产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，序列经BLAST数据库进行比对分析。

1.4统计学处理 采用Excel 2010进行数据分析。

2 结 果

2.1菌株分布 1 785株肺炎克雷伯菌分离自痰液的占63.47%，分离自血液的占10.25%，分离自尿液的占9.36%，其他来源占16.92%；检出率位于前9位的科室依次为脑外科(25.77%)、神经内科(12.83%)、呼吸科(10.14%)、胸外科(6.61%)、重症监护室(6.55%)、血液科(4.87%)、骨科(4.08%)、普外科(2.91%)、中医科(2.24%)。121株CRKP主要分离自重症监护室。

2.2药敏试验结果 1 785株肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦的敏感率为95.49%，药敏试验结果见表1。121株CRKP对头孢他啶/阿维巴坦的敏感率为80.17%，药敏试验结果见表2。

表1 1 785株肺炎克雷伯菌药敏试验结果(%)

表2 121株CRKP对补充抗菌药物的药敏试验结果(%)

2.3mCIM及eCIM检测结果 对121株CRKP进行mCIM及eCIM检测，其中101株mCIM阳性，占83.5%(101/121)，产碳青霉烯酶；101株mCIM阳性菌株中，22株eCIM阳性，占21.8%(22/101)，产金属β-内酰胺酶。

2.4碳青霉烯酶抑制增强试验结果 对121株CRKP进行碳青霉烯酶抑制增强试验，78株产丝氨酸酶，占64.5%；22株产金属β-内酰胺酶，占18.2%；1株同时产丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶(该菌株在mCIM和eCIM联合检测时被误判为仅产丝氨酸酶)，占0.83%。

2.5碳青霉烯酶耐药基因检测结果 对19株CRKP进行blaKPC-2、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、blaNDM-1、blaOXA-48共7种常见碳青霉烯酶耐药基因的扩增，其中15株检测出blaKPC-2,3株检测出blaNDM-1，1株同时检测出blaNDM-1和blaKPC-2。见图1。

注：A为部分菌株耐药基因blaKPC-2的检测结果，其中1为阳性对照，2～4为临床菌株；B为耐药基因blaNDM-1的检测结果，其中5为阳性对照，6～8为临床菌株。

3 讨 论

近年来，由于广谱抗菌药物的广泛使用，肺炎克雷伯菌耐药情况日趋严峻。肺炎克雷伯菌感染，尤其是CRKP感染的控制和治疗成为临床重点关注的问题。肺炎克雷伯菌的耐药机制主要包括产超广谱β-内酰胺酶、碳青霉烯酶、头孢菌素酶(AmpC)，膜孔蛋白缺失或突变，外排泵过度表达等。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药最常见的原因是产碳青霉烯酶[6]。Ambler分类法将碳青霉烯酶分为A、B、D 3类,A类酶包括KPC、GES、IMI、SME和SFC，其活性部位含有丝氨酸结构，属于丝氨酸酶，部分可被克拉维酸抑制；B类酶包括NDM、VIM、SPM、GIM、SIM和IMP，其活性部位含有锌离子，属于金属酶，能被EDTA抑制；D类酶主要包括OXA-48。阿维巴坦可抑制A类和某些D类碳青霉烯酶。

本研究中，CRKP对头孢他啶/阿维巴坦的耐药率为19.83%，对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为93.07%，该结果与国内同类研究类似[7]；而CRKP对米诺环素的耐药率为15.64%，低于同类研究[7]。本研究对121株CRKP进行了mCIM和eCIM检测，产碳青霉烯酶菌株检出率为83.5%，其中产金属β-内酰胺酶菌株占21.8%，该结果比其他研究产碳青霉烯酶菌株的检出率(44.83%)高[8]，可能与地区差异和菌株流行差异有关。1株同时产丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶的CRKP在mCIM和eCIM联合检测时被误判为仅产丝氨酸酶，而在碳青霉烯酶抑制增强试验中，该菌株被准确检测出了上述两种酶。碳青霉烯酶抑制增强试验能够准确检测酶型，但除了A类酶和B类酶以外，其不能有效区分是否产碳青霉烯酶，还是仅为碳青霉烯酶和/或AmpC酶合并膜孔蛋白的下调或缺失。提示mCIM、eCIM和碳青霉烯酶抑制增强试验联合使用可能能更准确地检测出D类酶[9]。本研究检测出2种碳青霉烯酶基因blaPKC-2和blaNDM-1，未检测出blaIMP、blaVIM、blaOXA-48等基因型和变异，可能与检测的样本量较少有关[10]。

肺炎克雷伯菌对头孢他啶/阿维巴坦敏感，CRKP导致的严重感染也可使用头孢他啶/阿维巴坦治疗。药敏试验和碳青霉烯酶耐药基因鉴定对合理使用抗菌药物具有重要意义。