解脲支原体和人型支原体的液体培养法和固体培养法比较及耐药性分析*

林丽英，马芙蓉，郭旭光，夏 勇

广州医科大学附属第三医院检验科，广东广州 510150

支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最简单的原核生物之一。目前，已经发现至少有16种支原体能寄居于人体，7种为条件致病菌，其中以解脲支原体(Uu)和人型支原体(Mh)最为常见。Uu和Mh主要寄居于人体的泌尿生殖道，通过性接触传播，可引起尿道炎、前列腺炎等泌尿生殖道感染；亦可经胎盘传播，引起早产、自然流产、先天畸形、死胎和不孕症等；经产道感染可导致新生儿肺炎或脑膜炎[1-3]。支原体(包括Uu和Mh)感染早期患者无症状或症状不明显，导致患者未能及时诊断、治疗。目前，Uu和Mh的检测多采用液体培养法，该方法快速、简便，且附带药敏试验结果，但其准确性有待进一步明确。固体培养法可通过显微镜观察到支原体典型菌落，是诊断支原体感染的“金标准”，但其操作相对烦琐，临床应用较少[4-5]。临床常用四环素类、大环内酯类及喹诺酮类抗菌药物治疗泌尿生殖道支原体感染，但近年来随着抗菌药物的广泛使用，支原体的耐药性也在不断增强，这给临床治疗带来了一定的困难[6-7]。快速准确地诊断泌尿生殖道支原体感染，从而进行有针对性的抗感染治疗有重要的临床意义。本研究将液体培养法检测Uu和Mh的性能与固体培养法进行比较，并进一步分析Uu和Mh的耐药性，旨在为临床诊断及治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1标本来源 选取2017年10-12月本院采集的819份泌尿生殖道支原体培养标本为研究对象，其分别来自妇科、不孕不育科、泌尿外科等科室。其中706份标本来自女性，年龄19～69岁，采用无菌拭子取宫颈口1.0～1.5 cm处分泌物；113份标本来自男性，年龄24～59岁，采用无菌拭子取尿道口1.0～1.5 cm处分泌物。

1.2仪器与试剂 Uu和Mh分离、鉴定、药敏试验试剂盒(众爱生河北生物科技有限公司)；Uu和Mh选择分离固体培养基(众爱生河北生物科技有限公司)；BX43光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；恒温培养箱(美国赛默飞世尔公司)。

1.3方法

1.3.1液体培养法 提前将试剂复温至室温，先从未接种标本的培养液中取100 μL加入药敏板的阴性对照孔。将采集的标本拭子置于液体培养基内反复搅拌、充分洗涤，并在瓶壁内挤压，确保全部标本都溶于培养液中，丢弃棉拭子，然后取100 μL混合液放入检测板各孔中(除阴性对照孔外)，滴加石蜡覆盖，编号后放入(36±1)℃恒温培养箱孵育。培养48 h后观察结果，阴性对照孔培养后仍为澄清黄色液体则提示实验有效。Uu或Mh的对照孔、鉴定孔和计数孔培养液由黄色变为红色且澄清者判定为Uu阳性或Mh阳性；Uu和Mh两孔均变红且澄清者为Uu和Mh混合感染，即Uu+Mh阳性；培养液及阴性对照孔无颜色变化判定为阴性；培养液变红但出现明显浑浊或沉淀且对应固体培养基上Uu或Mh生长则判定为液体培养基污染。药敏试验结果判读：低浓度孔及高浓度孔均不变色为敏感，低浓度孔变红、高浓度孔不变色为中介，低浓度孔及高浓度孔均变红为耐药。

1.3.2固体培养法 将采集的标本在2 h内接种，先将拭子在固体培养基上划线接种，随后放入CO2发生片，盖上盖子，编号后放入(36±1)℃恒温培养箱孵育。培养48 h后，在低倍镜下观察固体培养基上是否有支原体特征性菌落生长，若见到典型棕褐色海胆样菌落或不典型微小菌落(菌落中有沙粒状物质或黏附上皮细胞生长的片状物质)为Uu阳性；若见到煎蛋样或草帽样菌落(最大径100～300 μm)为Mh阳性；若同时见到上述两种菌落生长则为混合感染，即Uu+Mh阳性；若无菌落生长，则为阴性。若固体培养基上有混合菌生长并影响观察，则判定为固体培养基污染。

1.4统计学处理 采用SPSS25.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种方法检出率比较 819份标本中，液体培养法和固体培养法均阳性的共374份(无污染标本)，其中47份为Uu+Mh混合感染，检出率为5.74%(47/819)。液体培养法对Uu和Mh的检出率分别为52.14%(427/819)和13.06%(107/819)。固体培养法对Uu和Mh的检出率分别为43.83%(359/819)和7.69%(63/819)。液体培养法对Mh和Uu的总检出率为53.97%(442/819)，高于固体培养法的总检出率[45.79%(375/819)]，差异有统计学意义(χ2=583.18，P<0.05)。见表1～3。

表1 液体培养法和固体培养法对Uu的检出情况(n)

表2 液体培养法和固体培养法对Mh的检出情况(n)

表3 液体培养法和固体培养法对Mh和Uu的总检出情况(n)

2.2液体培养法检测Uu、Mh的效能 以固体培养法检测结果为“金标准”，液体培养法检测Uu的灵敏度为100.00%，特异度为85.22%；检测Mh的灵敏度为98.41%，特异度为94.05%。见表4。

表4 液体培养法检测Uu、Mh的效能(%)

2.3药敏试验结果分析 对374份支原体阳性(液体培养法和固体培养法均为阳性)标本的药敏试验结果分析发现，其对诺氟沙星和环丙沙星有较高的耐药率，分别为97.33%和88.24%；其次为壮观霉素和氧氟沙星，耐药率分别为83.42%和74.87%；对米诺环素、交沙霉素和多西环素的敏感率较高，分别为76.20%、63.37%和62.83%。见表5。

表5 374份支原体阳性标本的药敏试验结果[n(%)]

3 讨 论

Uu和Mh是引起泌尿生殖道感染的重要病原体之一，由其引起的感染占非淋病性泌尿生殖道感染的20%～30%，Uu和Mh主要通过性接触和母婴传播。支原体感染可导致非淋病性尿道炎、男性前列腺炎、女性阴道炎、盆腔炎、不孕不育和异常妊娠等[4]。近年来，随着人们性意识的开放及无保护性行为的增加，支原体的感染率也越来越高，且由于抗菌药物的不规范使用及耐药基因的出现，支原体耐药率也越来越高，严重威胁人类健康[8-9]。因此，及时准确地诊断支原体感染，并进行有效的抗感染治疗具有一定的临床意义与现实价值。

目前，Uu、Mh的培养方式分为液体培养法和固体培养法两种。液体培养法是基于培养和生化反应，通过Uu分解尿素、Mh分解精氨酸产生氨，使pH值上升，培养液的酚红指示剂由黄色变成红色，从而判断感染情况的检测方法，此方法操作简单、价格较低，同时具有可进行药敏试验的优点，在临床上被广泛应用[10]。但液体培养法结果仅依靠肉眼观察具有一定的主观误差，同时其检测原理的特异性不强，导致假阳性率较高。固体培养法则是直接在显微镜下观察Uu、Mh的生长情况，是诊断感染的“金标准”[11]。由于Uu、Mh菌体较小，临床上仍存在不典型的菌落，因此固体培养法对检验人员的专业技能与临床实践经验有较高的要求。临床泌尿生殖道支原体感染中，Uu的感染率高于Mh。杨书才等[12]对6 493例泌尿生殖道感染患者Uu和Mh的感染情况进行分析发现，Uu单纯感染2 300例(35.4%),Mh单纯感染75例(1.2%)，二者混合感染639例(9.8%)。本研究结果显示，固体培养法Uu和Mh的检出率分别为43.83%(359/819)和7.69%(63/819)，二者混合感染的检出率为5.74%(47/819)，Uu的检出率明显高于Mh。从检测方法来看，液体培养法对Mh和Uu的总检出率高于固体培养法(53.97%vs.45.79%)，提示液体培养法的检测结果存在一定的假阳性。本研究中，液体培养法检测Mh的阳性预测值仅为57.94%，检出45份Mh假阳性标本可能与某些细菌或真菌分解精氨酸产生氨造成液体培养呈假阳性有关。张红升等[13]从227份浑浊的支原体培养液中分离出94株细菌，其中12株可分解精氨酸，造成Mh假阳性。此外，还有研究表明，支原体液体培养法的生化反应特异性差，不是支原体所特有；且标本本身的上皮细胞、白细胞等可引起液体浑浊，影响结果的判断[14]。综上所述，液体培养法虽然灵敏度高、操作简单，但检测结果存在一定的假阳性，可将液体培养法作为初筛试验，用固体培养法进一步确诊，两者相结合可提高诊断的准确性，帮助临床诊断与治疗。

郑杰[15]报道了唐山地区Uu对米诺环素、多西环素和交沙霉素的敏感率依次降低；严富洪等[16]报道了上海地区Uu对交沙霉素、米诺环素、克拉霉素的敏感率依次降低；何国华等[17]发现，Uu对多西环素、米诺环素、交沙霉素、克拉霉素敏感率较高，Mh对多西环素、米诺环素、交沙霉素的敏感率在86%以上。本院374份支原体阳性标本对诺氟沙星、环丙沙星、壮观霉素和氧氟沙星有较高的耐药率，分别为97.33%、88.24%、83.42%和74.87%；对米诺环素、交沙霉素和多西环素的敏感率较高，分别为76.20%、63.37%和62.83%。吴银花[18]对广西地区3 758份泌尿生殖道支原体感染标本进行药敏试验发现，其对米诺环素、多西环素、交沙霉素的敏感率较高，分别为91.13%、80.15%和76.63%，与本研究结果类似。本研究结果表明，对支原体(Uu、Mh)感染患者的治疗可首选米诺环素、交沙霉素和多西环素，依据患者药敏试验结果合理使用抗菌药物，在提高治疗效果的同时也可避免抗菌药物滥用造成的多重耐药。