应用多色探针熔解曲线分析法检测湘潭地区G6PD缺乏症基因突变*

李晨辉，王淑媛，袁海斌，殷 伟,刘春梅

湖南省湘潭市妇幼保健院优生遗传科，湖南湘潭 411101

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是人类最常见的遗传代谢病之一，为X连锁不完全显性遗传病，患有G6PD缺乏症的新生儿易出现黄疸，严重者可导致脑损伤，甚至死亡[1]。G6PD缺乏症尚无特效治疗方法，仅能通过对症治疗缓解患儿症状，我国是该病的高发区之一，呈现“南方高北方低”的分布特点[2-3]。对新生儿进行G6PD缺乏症早期筛查也是防治新生儿高胆红素血症的重要手段[4]。筛查G6PD缺乏症的方法很多，主要分为酶学诊断和基因诊断两大类。酶学诊断简便、快捷、价格低廉，但不同类型的基因突变因累积酶的功能部位不同而表型迥异，且该方法不能有效检出女性杂合子；而基因诊断中，传统的检测方法需要PCR后处理，易造成PCR产物污染，操作烦琐、成本高[5]，本院应用多色探针熔解曲线分析(MMCA)技术建立了G6PD基因诊断体系，具有操作简单、快捷、高通量、高自动化、低成本等优势。本研究以外显子基因测序(Sanger测序)法为“金标准”，比较酶活性法与MMCA法在G6PD缺乏症诊断中的价值，以期为G6PD缺乏症的早期诊断提供更有效的方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 2017年1月至2020年9月在本院新生儿疾病筛查中心进行G6PD缺乏症筛查的90 221例新生儿中，初筛阳性1 024例，召回952例，以其中454例同时进行G6PD酶活性法检测和基因检测(MMCA法、Sanger测序法)的新生儿作为研究对象，男309例，女145例，年龄3～60 d。纳入研究的患儿家属均对本研究知情同意。

1.2仪器与试剂 干血斑G6PD荧光定量分析法试剂盒和1420型荧光分析仪购于美国PerkinElmer公司；G6PD定量酶活性测定试剂盒购于北京华宇亿康生物工程技术有限公司，T600型全自动生化分析仪购自日本日立公司；G6PD基因突变检测试剂盒(货号：YZB/国1217-2015)、Lab-Aid 824全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂(货号：604001)购自厦门致善生物科技有限公司；SLAN-96S实时荧光定量PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司。

1.3方法

1.3.1新生儿G6PD缺乏症初筛 取出生后3～7 d新生儿足跟血，制成干血斑，由专人送至新生儿疾病筛查中心集中检测。采用G6PD荧光定量分析法进行G6PD水平检测。实验操作按试剂盒说明书要求进行。以1 g血红蛋白中G6PD<2.6 U为初筛阳性。

1.3.2酶活性法定量检测G6PD水平 采集G6PD缺乏症初筛阳性新生儿静脉血2 mL(乙二胺四乙酸抗凝)，检测红细胞G6PD活性，严格按照试剂盒说明书要求进行检测。G6PD参考值为1 700～2 600 U/L，当红细胞中G6PD<1 700 U/L为G6PD缺乏症。

1.3.3MMCA法检测G6PD基因突变 干血斑标本的核酸提取根据Lab-Aid 824全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂说明书进行操作。基因分型采用G6PD基因突变检测试剂盒,在SLAN-96S实时荧光定量PCR仪上进行检测，根据标本检测结果与野生型对照熔解峰差异来判读G6PD基因突变情况。MMCA法采用荧光PCR熔解曲线，根据靶探针杂交产物熔点的差异检测G6PD基因突变，可同时检测12种常见突变类型，包括c.95A>G、c.383T>C、c.392G>T、c.487G>A、c.517T>C、c．592C>T、c.871G>A、c.1004C>A、c.1024C>T、c．1360C>T、c.1376G>T、c.1388G>A，以及4种少见突变类型(科研位点)c.1387C>T、c.493A>G、c.519C>T、c.1381G>T。结果判读：比较待测标本与野生型对照熔解峰之间熔点(Tm值)的差异，ΔTm值在±1 ℃为野生型峰(阴性)，超过±2 ℃为突变型峰(阳性)。通过查阅人类基因突变数据库(HGMD)及文献鉴定每个突变位点的性质和蛋白功能改变。

1.3.4G6PD基因突变全基因组测序 应用Sanger测序法对G6PD基因的2～12外显子及外显子-内含子的剪切区域进行测序分析,若检测出突变基因则为阳性,反之为阴性。标本测序由浙江博圣生物技术股份有限公司完成。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验；诊断结果的一致性判断采用Kappa检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种方法对G6PD缺乏症筛查阳性新生儿的检测结果比较 在454例同时进行G6PD酶活性法、MMCA法及Sanger测序法检测的新生儿中，酶活性法检测出男性阳性165例，女性阳性25例；MMCA法检测出男性阳性164例，女性阳性42例；Sanger测序法检测出男性阳性169例，女性阳性42例。见表1。

表1 3种方法对G6PD缺乏症筛查阳性新生儿的检测结果比较(n)

2.2G6PD活性正常、基因突变阳性新生儿情况分析 酶活性法检测出的G6PD活性正常新生儿中，21例为G6PD基因突变阳性。该21例新生儿出生体质量、胎龄均正常，包括4例男性(均有输血史和黄疸治疗史)和17例女性(其中3例有黄疸治疗史)。4例男性新生儿酶活性法的检测值为1 700～2 000 U/L，G6PD基因突变类型全部为c.1376G>T；17例女性新生儿酶活性法的检测值>1 900 U/L，G6PD基因突变类型为c.1376G>T 8例，c.1388G>A 6例，c.519C>T 1例，c.1024C>T 1例及c.871G>A 1例。

2.3G6PD基因多态性分布情况 454例新生儿中共检出G6PD基因突变211例。检出常见突变类型为c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A、c.392G>T、c.487G>A、c.1004C>A、c.1360C>T、c.517T>C；检出少见突变类型为c.519C>T；Sanger测序法检出c.1003G>A、c.152C>T、c.585G>T、c.94C>G。G6PD基因突变比例最高的前3位为c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G。MMCA法共检出11种突变类型，其中男性半合子突变10种，女性杂合子突变9种，女性未见纯合子和复合杂合突变。Sanger测序法检出15种突变类型，其中男性半合子突变14种，女性杂合子突变9种，女性未见纯合子和复合杂合突变。见表2。

表2 G6PD基因多态性分布情况[n(%)]

续表2 G6PD基因多态性分布情况[n(%)]

2.4酶活性法与Sanger测序法检测结果比较 以Sanger测序法为G6PD缺乏症基因诊断的“金标准”，对酶活性法进行方法学评价，结果显示，酶活性法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为97.6%(165/169)，特异度为100.0%(140/140)，阳性预测值为100.0%(165/165)，阴性预测值为97.2%(140/144)。酶活性法诊断女性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为59.5%(25/42)，特异度为100.0%(103/103)，阳性预测值为100.0%(25/25)，阴性预测值为85.8%(103/120)。酶活性法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性较好(Kappa=0.974，P<0.05)，诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性一般(Kappa=0.676，P<0.05)。见表3、4。

表3 酶活性法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果(n)

表4 酶活性法与Sanger测序法诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果(n)

2.5MMCA法与Sanger测序法检测结果比较 以Sanger测序法为G6PD缺乏症基因诊断的“金标准”，对MMCA法进行方法学评价，结果显示，MMCA法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为97.0%(164/169)，特异度为100.0%(140/140)，阳性预测值为100.0%(164/164)，阴性预测值96.6%(140/145)。MMCA法诊断女性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为100.0%(42/42)，特异度为100.0%(103/103)，阳性预测值为100.0%(42/42)，阴性预测值为100.0%(103/103)。MMCA法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性较好(Kappa=0.967，P<0.05)，诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果完全吻合(Kappa=1.000，P<0.05)。有5例男性新生儿用MMCA法检测出现假阴性结果，Sanger测序法显示1例为c.585G>T，1例为c.94C>G，1例为c.152C>T，2例为c.1003G>A。见表5、6。

表5 MMCA法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果(n)

表6 MMCA法与Sanger测序法诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果(n)

3 讨 论

G6PD缺乏症是一种X染色体连锁不完全显性遗传的红细胞酶缺陷病，男性只有1条X染色体，所以G6PD缺乏症表型为酶活性明显降低的半合子；而女性有2条X染色体，所以女性G6PD缺乏症表型为杂合子或纯合子，且大部分女性为杂合子，本研究基因诊断为G6PD缺乏症的42例女性患儿均为杂合子。女性杂合子患儿的酶活性可表现为正常、轻度缺乏、中度缺乏和显著缺乏[6]，因此，只筛查酶活性会漏诊表型正常的女性杂合子患儿,G6PD缺乏症杂合子是新生儿高胆红素血症发生的独立危险因素之一[7]，所以进行基因检测对女性杂合子患儿的筛查很重要。本研究对454例初筛为G6PD缺乏症的患儿采用酶活性法与MMCA法分别检测G6PD活性与基因突变类型，其中基因突变类型共检出15种，c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是湘潭地区最常见的G6PD基因突变类型，与湖南省其他地区的相关报道结果相符[8-9]。本研究检出了21例酶活性正常，而MMCA法和Sanger测序法的检测结果为阳性的新生儿，包括4例男性新生儿和17例女性新生儿，考虑出现该结果可能有以下几个原因：(1)同义突变未引起氨基酸的改变，突变为多态性位点；(2)新生儿急性溶血期由于新生红细胞G6PD活性偏高可能导致酶活性法检测结果偏高；(3)在急性溶血期，由于新生儿血液中幼稚红细胞较多，G6PD活性较高；(4)其他未知原因造成的假阴性结果[10]。询问21例新生儿的相关病史，4例男性新生儿有输血史和黄疸治疗史；17例女性新生儿中3例有黄疸治疗史，因此女性新生儿只有进行G6PD基因检测才能提高杂合子的检出率。

目前，临床上针对G6PD缺乏症的基因检测方法有很多种，如等位基因寡核苷酸探针杂交、变性梯度凝胶电泳、错配碱基PCR/限制性内切酶图谱分析、PCR-单链构象多态性分析、DNA测序等方法均可用于G6PD基因突变检测，但是上述方法成本高，操作过程复杂，耗时长，通量低，不适合大规模样本检测。MMCA法的主要原理是根据DNA序列长度、GC含量及碱基互补差异，应用高分辨率的熔解曲线对标本进行分析，其极高的分辨精度可达到对单一碱基差异的分析。本研究中首先采用酶活性法和MMCA法对454例初筛阳性的G6PD缺乏症患儿分别进行酶活性和基因检测，再以Sanger测序法的检测结果作为“金标准”，评价酶活性法和MMCA法的检测效能。对男性新生儿而言，酶活性法检测的灵敏度为97.6%，特异度为100.0%，与Sanger测序法的检测结果一致性较好；MMCA法检测的灵敏度为97.0%，特异度为100.0%，与Sanger测序法的检测结果一致性较好。表明用酶活性法和MMCA法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的效能高。对女性新生儿而言，酶活性法检测的灵敏度为59.5%，特异度为100.0%，与Sanger测序法的检测结果一致性一般；MMCA法检测的灵敏度、特异度均为100.0%，与Sanger测序法的检测结果完全一致，与胡韦维等[11]的相关研究结果相同。这也提示女性杂合子难以单纯根据酶活性进行准确诊断，因为存在漏诊风险[12]，因此，建议女性新生儿直接采用MMCA法进行检测。此外，本研究发现，与Sanger测序法的结果比较，MMCA法有5例假阴性结果，分析其原因：G6PD基因突变检测试剂盒(MMCA法)是根据目前已报道的中国人群G6PD基因突变的等位基因频率，选择了16种常见的突变位点设计相应的引物和探针，因此其检测范围与突变位点的位置有关；而Sanger测序法是针对除了第1外显子以外的所有G6PD基因外显子进行检测，其覆盖范围比MMCA法更广。而MMCA法检测出的这5例假阴性男性患儿Sanger测序法检测结果为c.585G>T(1例)、c.94C>G(1例)、c.152C>T(1例)、c.1003G>A(2例)，由于这些突变类型不在MMCA法引物和探针设计的检测范围内而无法被检出。因此，对临床高度疑似或者MMCA法试剂盒未覆盖的未知突变标本要用Sanger测序法确诊。

与Sanger测序法相比，MMCA法具有以下优点，(1)检测快速、高通量：可同时检测46份标本，并在2.5 h内完成；(2)操作简便：PCR与荧光探针杂交在同一反应体系内实时进行，不需要PCR扩增后的杂交过程；(3)不易污染：闭管操作，无需PCR后处理；(4)方法可靠、结果易判断：其结果自动判断，减少人为因素判读失误；(5)成本更低[13-14]。

综上所述，与传统的酶活性法比较，MMCA法具有灵敏度、特异度高的优点，是一种快速、准确、适用于临床诊断G6PD缺乏症的方法。