基于网络药理学探讨赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血的作用机制

丁 宁，王晓梅，徐世杰

（中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700）

异常子宫出血（abnormal uterine bleeding，AUB）是妇科常见病，严重威胁妇女的身心健康，主要指与正常月经的规律性、周期频率、经期出血量、经期长度任何1项不符的源自子宫的异常出血［1-3］。据统计，在育龄女性中，异常子宫出血的发病率高达10%～30%；在围绝经期患者的所有妇科问题咨询中，异常子宫出血占70%以上［4，5］。异常子宫出血以其发病率高、病因复杂、治疗尚不规范等特点，已经成为临床中极为棘手的问题。而中医药作为一种安全有效的治疗手段，逐渐得到临床医生和患者的广泛认可［6］。

赤芍与牡丹皮配伍，赤芍散瘀血留滞，能清血分实热，牡丹皮清热凉血的作用较佳，既能清血分实热，又能治阴虚发热，二者合用，对于治疗以血瘀和血热为主要病机的妇科崩漏有较好的治疗效果。动物实验证明赤芍与牡丹皮配伍能够明显改善血液流变学、凝血功能指标、血小板系统等多项指标，抑制血小板黏附率、增加血小板e NOS、p-e NOS蛋白表达水平，具有较强的活血化瘀作用；药学研究表明赤芍与牡丹皮合煎具有配伍合理性，能够促进有效成分的溶出，提高活血化瘀疗效［8］。而赤芍-牡丹皮药对也被广泛应用于异常子宫出血的治疗，同时作用中药处方或中成药主要成分被指南推荐［9］。为进一步深入研究赤芍-牡丹皮药对异常子宫出血的作用机制，本研究采用网络药理学的研究方法，挖掘赤芍-牡丹皮药治疗异常子宫出血的作用机制，为其进一步研发提供参考，为临床应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 赤芍-牡丹皮药对的主要成分及作用靶点信息的获取

通过中药系统药理学分析平台——TCMSP数据 库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查 找 赤芍-牡丹皮药对的成分，并根据药动学参数筛选其中符合口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 的成分；通过文献挖掘的方式对赤芍-牡丹皮药对成分中不满足上述药动学参数但具有药理作用的成分进行补充。运用TCMSP数据库查询出主要活性成分的作用靶点，并利用Uniprot数据库（https：//uniprot.org/）得到对应靶点的基因号及标准化命名。

1.2 异常子宫出血疾病靶点的收集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）和TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）等数据库对异常子宫出血的疾病靶点进行检索和汇总，检索关键词为“abnormal uterine bleeding”。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建

通过使用R软件获取赤芍-牡丹皮药对与异常子宫出血共同靶点，绘制Venn图，并将靶点信息输入String平台构建可视化的蛋白互作PPI网络。

1.4 药物-化合物-作用靶点-疾病作用网络图搭建

使 用Cytoscape3.7.2 软 件（http：//www.cytoscape.org/），将赤芍-牡丹皮药对与异常子宫出血中药物、成分、靶点、疾病之间的相互关系构建可视化互作网络图，进行网络特征分析，从而使成分、靶点的重要性更加数据化，网络图中的节点分别代表了药物、活性成分、基因靶点和疾病，连线代表上述节点之间的相互联系。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

利 用Bioconductor（http：//www.bioconductor.org/）在线数据库对得到的靶标基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。以P＜0.05 作为条件进行筛选，将前20条基因生物过程和信号通路利用在线工具将富集的通路进行高级气泡图的可视化分析。

2 结果

2.1 赤芍-牡丹皮药对的主要活性化合物及作用靶点

使用TCMSP数据库初步检索得到赤芍-牡丹皮药对的活性成分共174个，其中赤芍119个，牡丹皮55个。根据药动学参数（OB≥30%和DL≥0.18）筛选后共得到主要活性成分39个，基于文本挖掘方法对主要活性成分进行补充后，共获得40个主要活性化合物，见表1。

表1 主要成分及其参数Tab1 Main constituents and their parameters

使用TCMSP数据库初步检索得到赤芍-牡丹皮药对的作用靶点1190个，对40个主要活性成分作用靶点进行筛选，并对其基因名标准化处理，删除无效和重复靶点后，最终获取作用靶点95个。

2.2 异常子宫出血的疾病靶点

共筛选得到与异常子宫出血相关的疾病靶点共2809个，采用UniProt和Drug bank数据库将靶蛋白统一转换为人源（Homo sapiens）的基因名。

2.3 赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血共同靶点筛选及互作网络构建

共得到赤芍-牡丹皮药对与异常子宫出血共同作用靶点67个，见表2；绘制Venn图，见图1；将67个基因在STRING平台进行PPI网络分析，并可视化处理，见图2。统计出现较多的30个节点并绘制出图形，可以发现白细胞介素-6（IL-6）、表皮生长因子受体（EGFR）、胱天蛋白酶3（CASP3）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）和血管内皮生长因子（VEGFA）等关联程度较高，是整个网络最重要的节点蛋白，见图3。

图1 韦恩图Fig1 Venn diagram

图2 PPI网络Fig2 PPI network

图3 蛋白频次条形图Fig3 Bar graph of target protein frequency

表2 共同作用靶点Tab2 Common targets

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络

使用cytoscape构建调控网络，共86个节点（疾病1个，药物2个，核心活性成分16个，靶点67个）和231条线，见图4。结果显示，槲皮素（quercetin）、黄芩素（baicalein）、山 柰酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、鞣 花 酸（ellagic acid）、儿 茶 素［（+）-catechin］等化合物可能是赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血发挥治疗作用的核心化合物。

图4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络图Fig4 Drug⁃ingredient⁃target⁃disease network

2.5 GO基因生物过程富集分析和KEGG信号通路富集分析

GO富集分析共得到87条生物过程，选择P值最小的20条生物过程绘制柱状图（见图5a），其中DNA结合转录激活剂活性（DNA-binding transcription activator activity）、RNA聚合酶II特异性（RNA polymeraseⅡ-specific）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）、激活转录因子结合（activating transcription factor binding）、核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性（transcription factor activity），直接的配体调节序列特异性DNA结合（direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）、类 固 醇 结 合（steroid binding）、核 激 素 受 体 结 合（nuclear hormone receptor binding）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合（RNA polymeraseⅡtranscription factor binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）等生物过程中靶点较为集中。

KEGG富集分析共得到116条信号通路，选择P值最小的20条信号通路绘制气泡图（见图5b、6），靶基因主要集中在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信号通路。

图5 GO功能（a）与KEGG通路（b）分析Fig5 Analysis of GO function（a）and KEGG pathway（b）

图6 KEGG通路分析图（TNF通路）Fig6 KEGG pathway analysis（TNF signaling pathway）

3 讨论

本次研究通过网络药理学的方法对赤芍-牡丹皮药治疗治疗异常子宫出血的作用机制进行预测，共得到16个主要活性成分，67个共同作用靶点，87条生物过程和116条信号通路。

在最终得到的16个主要活性成分中，有研究证实，槲皮素（quercetin）可以通过抑制血小板激活因子与血小板聚集起到止血的作用，此外，槲皮素还有较强的抗氧化作用和抗炎作用，也有研究证明它可以通过增加大脑和肌肉中线粒体的生成，清除氧自由基，从而增加运动耐力［10-14］。黄芩素（baicalein）可以增强细胞自噬水平、通过调控各种蛋白和凋亡因子的表达抑制细胞增殖和转移，黄芩素同样也有抗炎和免疫调节作用，研究证明黄芩素能明显抑制高糖导致血管平滑肌细胞从收缩型到合成型的表型转化，而且在各种神经系统疾病的体内、外实 验 模 型 中 均 有 神 经 保 护 作 用［15-19］。山 柰 酚（kaempferol）有显著的抑制炎症的作用，它通过抑制IKKβ的活化和IκBα的磷酸化，阻止NF-κB（p65）进入细胞核内，进而影响相关炎症介质的释放。也有研究证明山柰酚能够显著上调骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4基因的表达和AKT、GLUT4蛋白的表 达［20-22］。豆 甾 醇（Stigmasterol）与 儿 茶 素［（+）-catechin］均具有较强的体外抗氧化活性，鞣花酸（ellagic acid）可能通过抑制蛋白质降解起到增加肌肉功能的作用，也有基础研究证实其能够抑制A431和HSC-2细胞增殖，诱导其细胞凋亡并抑制侵袭［23-25］。

IL-6、EGFR、CASP3、MAPK8和VEGFA等是赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血出现频次最高的几个共同靶点。共同靶点的作用主要集中在平衡细胞增殖与凋亡、抑制异常增殖细胞的侵袭、调节激素分泌、改善细胞周期、促进凝血、抗炎等。IL-6作为一种常见的细胞因子，在炎症和B细胞的成熟中起重要的作用，研究证明在子宫内膜病变过程中伴随着IL-6的明显过表达［26，27］。EGFR有一定的促细胞增殖作用，在许多妇科疾病中均有不同程度的高表达，子宫内膜息肉是子宫异常出血的常见病因之一，一项来自新疆医科大学的研究发现子宫内膜息肉患者息肉旁内膜组织腺体EGFR的表达明显高于正常内膜的表达［28］。CASP3是一种与细胞凋亡密切相关的蛋白酶，来自贵阳医学院的一项研究证明CASP3的低表达可能促使细胞抗凋亡能力增强，导致细胞凋亡不足增殖过度，导致子宫内膜癌的发生［29］。MAPK8可以介导细胞的增殖、分化、凋亡、应激反应、炎症反应等，并且可以对性激素的分泌水平产生影响［30］。VEGFA在血管形成、肿瘤生长和发展、动脉粥样硬化等方面有重要的调节作用，一项来自广州中医药大学的研究证明其在围绝经期子宫肌瘤合并异常子宫出血的患者子宫内膜组织内过表达，且与碱性成纤维细胞生长因子相互调控促进子宫内膜的增生和异常出血的发生。已经有多项研究证明VEGFA是子宫内膜血管形成的重要调控因子，VEGFA的表达和异常出血的发生呈正相关的关系［31-34］。

GO生物过程富集分析包括DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、泛素样蛋白连接酶结合、activating激活转录因子结合、核受体活性、类固醇结合、核激素受体结合、类固醇激素受体活性等多种生物学过程，主要涉及细胞增殖和凋亡、血管内皮保护、炎症反应、激素分泌、氧化与抗氧化活性等作用，并且在细胞增殖与凋亡中体现了高度的结合活性，可作为赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血潜在的关键作用途径。KEGG信号通路富集分析结果中，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信号通路中基因较为集中。

TNF是一个炎症诱导细胞因子，TNF调节着很多重要的生物学活动，如免疫反应、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤发生TNF信号主要由其细胞膜受体TNF-R1和TNF-R2介导［35］。通过本次KEGG富集分析得到的TNF信号通路图中可以看到，赤芍-牡丹皮药可能通过激活下游不同的效应蛋白如JNK和NF-κB等，进而调控下游的靶蛋白如炎症细胞因子IL-6、细胞内信号因子NFκbia、转录因子Fos、细胞黏附因子Icaml等对异常子宫出血起到治疗作用。

本次研究通过网络药理学的方法从整体的角度对赤芍-牡丹皮药对治疗异常子宫出血的作用机制进行预测，发现赤芍-牡丹皮中槲皮素、黄芩素、山柰酚、豆甾醇、鞣花酸等成分直接作用于IL-6、EGFR、CASP3、MAPK8和VEGFA等相关靶点起作用，并可能通过Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信号通路调控细胞增殖和凋亡、保护血管内皮保护、抑制炎症反应、调节激素分泌等作用起到对异常子宫出血的治疗作用，初步对其潜在的作用机制、作用靶点、有效成分进行了探索和阐释，这也为赤芍-牡丹皮药对未来的临床应用提供了药效物质基础和客观依据。