基于网络药理学探讨芪术郁灵汤治疗食管癌的分子生物学机制研究

许博文，李 娟，李 杰，张潇潇，吴静远，曹璐畅，但文超

（1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 10002）

2018年全球癌症研究预测，食管癌（esophagus cancer，EC）在恶性肿瘤中发病率居第9位，死亡率居 第6位［1］，我 国EC患 病 率 和 死 亡 率 排 全 球 第5位［2］。此外，因占位压迫引起以进行性吞咽困难为主的消化道症状及化放疗的毒副反应，显著影响生存 质 量［3］。既 往 研 究 证 实［4，5］，中 医 药 在 辅 助 治 疗EC增效减毒，改善生存质量，明显延长无病生存期等发挥积极作用。因此，寻求中医药的协同治疗，对丰富EC治疗具有重大的临床意义与实践价值。

芪术郁灵汤［6］是笔者团队在中国中医科学院名老中医孙桂芝教授经验方二术郁灵丹［7］的基础上化裁形成，全方包括：黄芪、莪术、白术、郁金、威灵仙、石见穿。前期研究证实［8］，芪术郁灵汤可显著改善EC术后临床症状和生存质量。即芪术郁灵汤在EC治疗中存在很大的研究价值，但其分子生物学机制尚不清楚。

基于中药复杂系统特性，可能存在协同或拮抗作用，若是采用单一的机制研究不能体现中医药治疗疾病的整体性与多向性，也难以阐释本方对EC的机制。本研究引入具备多向调节的网络药理学研究方法，通过构建各成分间网络来分析其相互关系，充分关注网络中的关键节点，可系统阐述中药复方的物质基础及作用机制［9］，旨在探讨芪术郁灵汤治疗EC的分子生物学机制，为后续基础与临床研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 筛选芪术郁灵汤的活性成分与靶标

在中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索芪术郁灵汤各中药的化学成分。据ADME原则，类药性（drug likeness，DL）和口服利用度（oral bioavailability，OB）均是筛选药物的关键参数［10］，数值越大功能越强，故定为OB≥30%且DL≥0.18 。并收集既往文献研究中证实各中药中具有抗EC活性的化合物，对筛选结果进行补充与完善，获得候选化合物。将候选化合物在DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）中匹配靶点，并经Uniprot（https：//www.uniprot.org/）校正为标准基因名称。以Probability＝1为条件在SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）对候选化合物进行靶点预测，将两者汇总去重后得到药物靶标。

1.2 筛选食管癌靶点

在人类基因注释数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）、DrugBank、治 疗 靶 点 数 据 库（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）等检索“Esophagus cancer”。在GeneCards数据库中，若靶点过多宜设定score大于中位数的目标靶点作为潜在靶点［11］，汇总其余疾病数据库后去除重复值，获得疾病靶点。

1.3 “中药-化合物-靶点-疾病”构建

以Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物与疾病靶点取交集获得共同靶点，绘制韦恩图，并在Cytoscape3.7.2 构建“中药-化合物-靶点-疾病”网络。以“节点”（Node）代表属性类型，如中药、化合物、靶点和疾病，“边”（Edge）代表交互关系。采用Cytoscape内置Network Analyzer分析网络，重点关注连接度（Degree），连接度越大，涉及的生物功能越多，重要性也就越高，借以研究芪术郁灵汤较为重要的成分。

1.4 构建PPI网络

为探究候选基因间的交互作用，在STRING（https：//string-db.org/）构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）网络。并用BioGrid、InWeb_IM、OmniPath等数据库进 行PPI的挖掘分析，如果子网络包含3至500种蛋白质，则应用分子复合物检测算法（MCODE）来识别密集连接的网络特征，筛选核心网络模块。

1.5 富集分析

借助Metascape（http：//metascape.org/）对候选基因行基因本位（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。GO包括 分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component，CC），以诠释抗肿瘤生物过程；KEGG则研究主要抗肿瘤信号通路。筛选20个具有显著性差异的GO和KEGG，用R软件对结果进行可视化分析。基于显著通路映射相关靶标，构建“基因-通路”网络以进一步筛选芪术郁灵汤治疗EC关键靶基因。

2 结果

2.1 活性成分获取

在TCMSP中检索芪术郁灵汤各中药成分，虽部分化合物OB和DL值不符合要求，通过查看化合物“Related Disease”，纳入包含“Esophagus cancer”的化合物，共获化合物黄芪22个、莪术5个、白术10个、郁金20个、威灵仙8个、石见穿4个。经文献补充可干预EC的化合物，黄芪有AstragalosideⅣ［12］，莪 术 有curcumol［13］，白 术 有atractylenolide I、atractylenolideⅡ、atractylenolideⅢ［14］和atractylodes macrocephala［15］，郁金有curcumin［16］，石见穿有ursolic acid［17］。

2.2 药病靶点获取

在DrugBank中共获靶点353个；在SwissTargetPrediction中得到87个预测靶点，将所有靶点汇总后去重，共得到412个药物靶点。在Genecards、OMIM、DrugBank、TTD、DisGeNET分 别 得 到3 526、3640、64、9、672个靶点，汇总并去除重复值，共获得5884个疾病靶点。应用Venny取交集，得到297个共同靶点，经靶点映射，获得47个有效化合物，见图1、表1。

图1 韦恩图Fig1 Venny diagram

表1 芪术郁灵汤活性成分Tab1 Active ingredients of Qizhu Yuling decoction

2.3 “中药-化合物-靶点-疾病”网络图

该网络图由351个节点和1121条边组成，见图2。化 合 物 度 值 排 名 前7为quercetin、kaempferol、GLY、ursolic acid、naringenin、formononetin、isorhamnetin，分别对应164、60、59、55、38、32、31，这可能是芪术郁灵汤治疗EC较为重要的活性成分。考虑到所获候选靶点较多，选取度值≥9的靶点进行展示，见表2。

图2 “中药-化合物-靶点-疾病”网络Fig2 Network diagram of"herb⁃compound⁃target⁃disease"

表2 候选靶点信息（Degree≥9）Tab2 Candidate target information（Degree≥9）

2.4 PPI网络图

为展示更为重要的PPI网络节点，剔除21个游离节点，选取Drgree≥7进行图示，见图3。该网络中STAT3、MAPK1、TP53、MAPK3、AKT1、JUN、PIK3R1、SRC等存在较多的交互关系。

图3 PPI网络图（Degree≥7）Fig3 PPI network diagram（Degree≥7）

PPI复杂网络中存在部分密度较高的区域称为module，该区域内的网络具有较高的生物学意义。为更精确地分析芪术郁灵汤治疗EC的作用机制，得到核心PPI网络后，有必要通过MCODE进一步识别其内在module［11］，见图4。根据Log10（P）值，保留module中3个最佳评分的生物学进程对进行功能描述，见表3。

表3 芪术郁灵汤治疗EC的PPI网络内部潜在module功能描述（前3位）Tab3 Description of potential module function inside PPI network of Qizhu Yuling decoction in treatment of EC（top3）

图4 芪术郁灵汤治疗EC核心PPI网络内部潜在module网络Fig4 Qizhu Yuling decoction in the treatment of EC core PPI network internal latent module network

2.5 气泡图

GO显示共有2413个结果富集，其中2000个BP，133个CC，280个MF，KEGG富集119条通路。据neg.Log10（P）值排序，选择20个用R语言绘制气泡图，见图5。图左侧为富集名称，气泡颜色由红到蓝代表neg.Log10（P）值由大到小，气泡越大代表该通路的基因计数越多，横轴代表输入基因占该通路基因的比率。

从图5可知，涉及的主要GO有氧化应激（oxidative stress）、细胞周期（cell cycle）、凋亡（apoptotic）、细胞死亡（cell death）、转录因子（transcription factor）、膜传递（membrane transmission）、信号转导（signal transduction）及受体的活性与结合（related receptor activity and binding）。KEGG主 要包括癌症途径（Pathways in cancer）、细胞凋亡（Apoptosis）、自 噬（Autophagy）、MAPK signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway等。

图5 GO、KEGG气泡图Fig5 GO and KEGG bubble diagram

2.6 “基因-通路”网络图

基于显著差异的KEGG及所映射的基因，构建“基因-通路”网络，见图6。该网络共有20条信号通路、138个基因和476条关系。从网络中可知，AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3R1、RAF1、RELA具有较大的Degree，可能是芪术郁灵汤干预EC的关键靶基因。

图6 “基因-通路”网络图Fig6 "Gene⁃pathway"network diagram

3 讨论

研究表明，现代医学联合中医药治疗肿瘤有明确疗效［18］。食管癌归属中医“噎膈”范畴，《景岳全书·噎膈》载：“噎膈……必以忧愁思虑，积劳积郁……盖忧思过则气结，气结则施化不行……气不行则噎膈病于上”。外因责之饮食不节、七情内伤；内因责之脾肾渐虚，属局部癌毒实邪而全身消耗虚弱的疾病。由情志失调、脾胃虚弱，致气机失衡，痰瘀互结，“噎膈”而生［19］，治以理气扶正，化痰消癥。芪术郁灵汤是在二术郁灵丹基础上重视调畅气机，增加理气扶正药物，减少活血剂耗气之弊。

本方以黄芪、莪术为君，甘缓行气、破血消积、益气扶正而不助邪。郁金、白术为臣，疏肝健脾，助君药益气活血。威灵仙、石见穿为佐，共奏软坚散结、去腐生新之功。且君药现代药理学研究有明确的抗EC作用，如黄芪有效成分［20］可调控AKT信号通路诱导人食道癌HCE-4细胞凋亡；莪术提取物［21］可激活Caspase-9、Caspase-3和PARP，抑制Bcl-2，诱导人食管癌TE-8细胞凋亡。

3.1 潜在有效成分

本研究预测槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、glycine（甘氨酸）、ursolic acid（熊果酸）、naringenin（柚皮素）、formononetin（刺芒柄花素）、isorhamnetin（异鼠李素）等为干预EC的主要活性成分。

Quercetin通过下调Bcl-2蛋白与上调Bax蛋白表达，诱导EC细胞凋亡［22］，也呈剂量依赖性地抑制EC细胞增殖、侵袭、迁移及血管新生［23］，还能诱导细胞发生保护性自噬，以增强对肿瘤抑制作用［24］。Kaempferol显著抑制人食管鳞癌Eca-109细胞增殖和凋亡［25］，诱导发生G0/G1期阻滞，参与调控细胞周期。此外，Kaempferol对肿瘤糖酵解具有明显的抑制作用，还抑制表皮生长因子受体（EGFR）活性，是 治 疗EC有 效 候 选 化 合 物［26］。Glycine的 衍 生 物N-异喹啉-3-羧酸-L-甘氨酸苄酯在体内外实验中能提高细胞内活性氧水平，从而发挥抗EC作用［27］。体外研究发现，ursolic acid对食道癌KYSE150细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用，下调周期相关蛋白（CyclinD1）mRNA表达水平，诱导G0/G1阻滞［28］。Formononetin通过AKT通路诱导细胞凋亡，抑制人食 管 癌HCE-4细 胞 增 殖［29］。Isorhamnetin能 下 调bcl-2，c-myc和H-ras的表达，上调Bax，c-fos和p53的表达对人食道鳞癌Eca-109细胞发挥明确的抑制增殖和凋亡作用，还干预G2/M期阻滞，但目前缺少体内研究［30］。而naringenin暂无相关临床或实验研究，可能是芪术郁灵汤干预EC的新发现，有待进一步探究。

3.2 潜在基因靶标

本研究预测AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3R1、RAF1、RELA可能是芪术郁灵汤干预EC的潜在基因靶标。

AKT信号通路调控恶性肿瘤的增殖与分化，AKT1是关键基因，磷酸化AKT1（p-AKT1）可致EC患者局部无进展生存期（LPFS）明显缩短，是LPFS独立预后因素，故可测定p-AKT1的表达来预测EC局部复发的概率［31］。同样，p-AKT1也与患者总生存期（OS）降低有关［32］。TRIM27作为EC增殖因子，能增强AKT活化，促进EC中PI3K/AKT通路激活，以抑制凋亡［33］。也有研究发现δ样配体4（DLL4）能通过激活PI3K/AKT/E-钙黏蛋白途径而促进EC细胞侵袭与转移，沉默DLL4能够通过减少AKT磷 酸 化 而 抑 制EC的 生 长、转 移［34］。Liu等［35］也认为EC的发生与AKT异常激活有关，发现黄腐酚在EC中能够直接靶向AKT1/2，以APT竞争的方式抑制AKT激酶活性，降低CyclinD1的表达，并 提 高cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7、Bax、细胞色素C水平，促进凋亡，抑制EC的生长。

MAPK1、MAPK3是MAPK通 路 中 重 要 的 蛋白激酶与调控因子，调控MAPK1/3可降低EC细胞的增殖、侵袭与转移。MicroRNA-574-3p是EC患者术后预后指标，在EC组织中miRNA-574-3p可结合MAPK1并下调其表达，并由此抑制PI3K-Akt、快速活化Raf/MEK/ERK通路，抑制EC细胞增殖与侵袭［36］。也有研究发现miRNA-490-3p能够降解MAPK1，但miRNA-490-3p在EC组织中表达降低，而 致MAPK1诱 导 细 胞 增 殖、抑 制 凋 亡［37］。Zhu等［38］则发现食管鳞癌中多存在19p染色体缺失，19p染色体上的基因DIRAS通过MAPK3/1发挥信号调节作用，以诱导凋亡与抑制侵袭。

PIK3R1在正常组织中表达丰富，但在肿瘤中却表达降低。在探索中国人群中食管鳞癌潜在生物标记物的DNA甲基化谱中［39］，笔者发现PIK3R1的诊断价值颇高，仅次于PRDM16，即在晚期EC中发挥早期诊断作用。

RAF1对于肿瘤也具有重要影响，Zhou等［40］发现食管鳞癌中的PAQR3下调可促进RAF1表达，磷酸化ERK，调控转录以参与肿瘤增殖与分化；当上调PAQR3，可降低EC中RAF1水平，抑制肿瘤生长。Koinuma等［41］发现在食管鳞癌中RAF1可与Opa相互作用蛋白5（OIP5）相互作用，增加OIP5蛋白稳定性，促进细胞生长，导致患者不良预后。

RELA是NF-κB通路的关键组成，RELA能激活增殖或迁移相关基因表达以促使EC进展，即RELA过表达将促进EC细胞增殖、侵袭及转移，有研究通过抑制RELA表达证实能降低EC的增殖与转移［42］。在对EC的早期淋巴结转移研究中发现，RELA能增强mixed-lineage leukemia2（MLL2）诱导的EC细胞启动迁移相关的基因表达程序，而敲低MLL2可使转移性EC细胞明显减少，证实了MLL2和RELA是早期EC淋巴结转移的关键靶标［43］。

3.3 富集分析

依据研究结果，预测芪术郁灵汤主要通过MAPK通 路、NF-κB通 路 和PI3K-Akt通 路 及 其 交互作用共同发挥拮抗EC增殖、侵袭、转移、及复发，提高患者预后的作用。

MAPK通路参与肿瘤细胞分化、增殖、死亡等活动。FAT1作为肿瘤抑制因子，是EC的重要突变基因之一，FAT1可中断MAPK通路，解除对EMT的调控，从而影响EC的进展［44］。上调miRNA-134可降低丛状蛋白A1表达，以抑制MAPK通路，促进凋亡［45］；miR-148a通过ERK/MAPK通路和上皮-间质转化（EMT）直接靶向MAP3K9，抑制EC细胞的增殖和侵袭［46］。

NF-κB通路是连接癌症与炎症的主要传导途径，经典机制是由细胞暴露于炎性细胞因子（如TNF-α和IL-1）或响应于炎性信号（如LPS）而产生的［47］。NF-κB除能抑制肿瘤细胞增殖与转移，还能干预炎症［48］，即对伴有食管炎的EC，干预NF-κB途径可同时针对肿瘤和肿瘤相关性炎症，且RELA在EC中 高 表 达［49］。NF-κB还 有 助 于TNF-α诱 导EMT，完成血管生成和转移。

PI3K-Akt通路可刺激EC增殖、侵袭与转移，其激活可促进EC进展［50］。磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）是PI3K/AKT/mTOR通路主要负调控因子，与大多数mTOR通路表达呈负相关，PTEN表达缺失的患者总生存率明显降低［51］。此外，miR-302a被证实与EC细胞的生存能力和侵袭有关，miR-302a的过表达可抑制MAPK与PI3K/Akt通路中蛋白的磷酸化，影响EC细胞的增殖和侵袭［52］。有学者认为EC中失调的MAPK和PI3K通路通过多种机制激活，相关基因的激活或失活突变、扩增和过表达，将为EC靶向治疗提供相关依据［53］。

本研究采用网络药理学初步探讨芪术郁灵汤对EC的作用机制，其有效化合物如槲皮素、山柰酚、甘氨酸、熊果酸参与调节EC多数靶标，且在潜在 靶 标 中，AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3R1和RELA等显示出良好协同拮抗作用。同时也预测MAPK、NF-κB和PI3K-Akt通 路 及 其 交 互 作 用 在EC的增殖、侵袭、转移、复发及预后上，均发挥一定的优势作用。经网络药理学的挖掘，本研究能为临床上芪术郁灵汤用于EC的合理应用提供科学证据，也为开展后续基础研究或新药研发提供依据。