基于网络药理学探讨真武汤治疗糖尿病肾病的作用机制

刘 武，丁 宁，姜 赫，杜广华，宋 双，张 诏

（山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）的发病率约占糖尿病患者总发病人数的40%，是一种糖尿病微血管并发症，是导致终末期肾病的最常见因素［1，2］。据统计，在2015年，全球大约有4.15 亿糖尿病患者，预计到2040年，糖尿病患者将上升至6.42 亿人。1990～2012年，DKD导致的死亡率达到94%，是造成全球疾病负担的重要原因之一，因此，对DKD的治疗至关重要［1］。DKD发生机制已被证实与炎症反应、膜结合Toll样受体、核苷酸结合寡聚域等有关，受Wnt信号通路、TGF-beta信号通路以 及PI3K/AKT等 多 种 信 号 通 路 的 调 控［2，3］。目前，对DKD的治疗尚无特效措施，主要是对症治疗，即控制血糖、血压、血脂、蛋白尿等，至其发展到终末期肾衰竭则选择肾脏替代。现已有大量临床研究发现，中医中药在治疗DKD，延缓肾脏病理进展方面起到了重要作用，具有较好的疗效和安全性［4，5］。

真武汤源自张仲景的《伤寒论》，其药物组成为附子、茯苓、白术、白芍、生姜，整方具有温阳利水之效，现代医学扩展其应用于临床多种疾病的治疗，其治疗肾病综合征、慢性肾小球肾炎、DKD等肾脏疾病的疗效显著［6］。临床研究发现，真武汤对于痰瘀互结证2型糖尿病肾病患者具有良好的临床疗效，且能够改善血管内皮生长因子水平［7］。此外，动物实验证明，真武汤能够降低血清胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1，IGF-1）水平，使组织中IGF-1明显下调，以保护肾脏功能［8，9］。真武汤治疗DKD疗效显著，但是真武汤由五种药物组成，化学成分复杂，对于其治疗DKD的靶点和作用机制尚未明确。而网络药理学能够系统地反映药物对疾病网络的干预机制，体现中医药复方的多成分、多靶点、多途径的作用特征，有利于揭示中医药复方的科学性［10］。因此，本文采用网络药理学的方法，通过构建“中药-化学成分-疾病靶点”网络，以探究真武汤治疗DKD的作用机制，为临床应用真武汤提供证据。

1 资料与方法

1.1 真武汤中药物及其潜在靶点预测

利用中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine System Pharmacology，TCMSP）数据库分别检索真武汤中单味药：茯苓、白芍、生姜、白术、附子的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，且类药性（DL）≥0.18 为条件进行筛选，得出相应有效成分化合物信息。利用UniProt数据库对所获得的成分靶点信息进行规范统一。

1.2 DKD的疾病靶点收集

在人类基因组注释数据库（Genecards）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、Therapeutic Target Databas数 据 库（TTD）中 以“diabetic nephropathy”、“diabetic kidney disease”为检索词，获取DKD的疾病相关靶点。

1.3 真武汤治疗DKD靶点筛选

利用生物信息学与进化基因组学网（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/）将真武汤有效成分靶点与DKD疾病靶点进行分析合并，绘制Venn图，将其交集作为作用于方药对疾病的直接作用靶点。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将交集所得到的靶点上传至String数据库，物种选择“Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值为“medium confidence（0.400）”，余为默认值，构建PPI网络图。

1.5 真武汤成分-DKD-靶点网络的构建

将真武汤中各味中药及其化学成分、作用靶点以及DKD疾病靶点上传至Cytoscape3.7.2 软件中，构建中药-化学成分-疾病靶点网络图。

1.6 GO富集分析与KEGG通路分析

将交集所得到的靶点上传至DAVID数据库中进行GO富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular components，CC）、分子 功 能（molecular function，MF）及KEGG通 路分析。

2 结果

2.1 真武汤药物活性化学成分及对应靶点

通过TCMP数据库搜索真武汤中活性化学成分，根据所设置OB≥30%，DL≥0.18 为条件筛选，初步获取白芍活性化学成分13个，附子21个，白术7个，茯苓15个，生姜5个，去重后共得到59个化学成分。在TCMP数据库中共搜索得到对应靶点281个，运用Uniprot进行蛋白标准化命名，最终去重后得到靶蛋白103个。见表1。

表1 真武汤主要活性成分Tab1 Main active constituents of Zhenwu Tang

2.2 DKD相关靶点的获取

通过Genecards数据库搜索，收集到DKD相关靶点11247个，DN相关靶点3082个，设定Score大于中位数的目标靶点为DKD潜在靶点，最终筛选获得DKD相关靶点1408个，DN相关靶点1541个；通过OMIM数据库搜索收集到DKD相关靶点475个，DN相关 靶 点252个；通过TTD数据 库搜索收 集到DN相 关靶点19个，DKD相 关靶点1个，合并去重后最终得到疾病相关靶点2569个。

2.3 真武汤靶点与DKD靶点的筛选与PPI网络的构建

将真武汤获得的靶点基因与DKD潜在靶点取交集后，获得共用靶点66个，制作韦恩图，见图1。将获得的靶点上传至String数据库，获得蛋白相互作用PPI网络，见图2。在PPI网络图中共有66个节点，505条边，平均degree值为15.3 。通过Cytoscape3.7.2 中的cytoHubba插件以MCC算法对PPI网络中各个节点进行分析，筛选排名前10位的靶点，如图3。

图1 真武汤-DKD靶点韦恩图Fig1 Venn diagram of Zhenwu Tang-DKD targets

图2 真武汤-DKD靶点PPI网络Fig2 PPI network of Zhenwu Tang-DKD targets

图3 基于MCC算法的前十位Hub基因Fig3 Top10hub genes based on MCC algorithm

2.4 真武汤成分-DKD-靶点网络构建

利用Cytoscape3.7.2 构建真武汤中中药各化学成分-DKD-靶点网络图，如图4所示。运用Cytoscape3.7.2 中的NetworkAnalyzer分析得出各参数的degree值，degree值排名前5的化学成分是：β-谷甾 醇（β-sitosterol）、山 柰 酚（kaempferol）、豆 甾 醇（stigmasterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、3β-乙酰氧基苍术酮（3β-acetoxyatractylone）。

图4 真武汤成分-DKD-靶点网络图Fig4 Network of Zhenwu Tang components-DKD-targets

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

将上述66个靶点导入至DAVID数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析，真武汤参与的生物过程（BP）包括药物反应、雌二醇反应、脂多糖反应等，参与膜筏、细胞膜穴样凹陷、质膜、细胞外空隙等细胞组分（CC），参与酶结合、蛋白同源二聚化、血红素结合、氧化还原酶活动等分子功能（MF），对BP、CC、MF中排名前十的条目绘制气泡图，见图5～7。KEGG通路分析最终获得100条信号通路，主要涉及hepatitis B、TNF信号通路、肿瘤信号通路等，对排名前十的条目绘制气泡图，见图8。

图5 GO生物过程富集分析Fig5 GO biological process enrichment analysis

图6 GO细胞组分富集分析Fig6 GO cellular component enrichment analysis

图8 KEGG通路分析Fig8 KEGG pathway analysis

图7 GO分子功能富集分析Fig7 GO molecular function enrichment analysis

3 讨论

根据DKD的临床表现特点，中医将其归为“水肿”、“尿浊”等范畴，本病的发生多因饮食不节、情志失调、劳倦内伤、先天禀赋不足等所致，由消渴病发展而来。如《圣济总录》所言：“消渴病久，肾气受伤”、“此病久不愈，能为水肿痈疽之病”，消渴病日久伤及肾气，肾气受伤，精微不固，流失则成尿浊，水液代谢失常，犯溢肌肤又发为水肿，最终发展为消渴病肾病。本病与肺、脾、肾三脏相关，而多从脾肾立论，为本虚标实之症，以脾肾亏虚为本，瘀血、痰浊、湿热等邪气稽留为标。现代医家对DKD的认识不断发展，南征［11］认为气虚、阳虚、痰凝、气滞、瘀血等多种病理因素相互作用、互为标本，导致脏腑气机失调，阴阳失衡，其中毒邪寓于诸邪之中，为共性因素，最终提出毒损肾络是消渴肾病的病机关键。高亚斌等［12］认为内热为DKD的始动因素，内热日久伤及血分，化瘀生痰，郁结肾络，形成癥瘕，DKD的核心病机即为“内热致癥”。

真武汤可用于DKD脾肾阳虚，水湿内蕴之证，以温补脾肾之阳，化浊利水。方中以附子温肾阳，暖脾土，用为君药，使水湿得以运化。以茯苓、白术为臣药，行健脾燥湿、渗湿之功，使湿邪自小便而去。白芍为佐，《神农本草经》谓“利小便”，在此利小便以行水气，且能够制约君药附子之燥烈，舒筋缓急止痛。生姜亦能温阳散寒，以助附子散水湿。本研究通过对真武汤中5味中药活性化学成分进行分析，构建真武汤活性化学成分-疾病-靶点网络图，得到网络中关键化学成分为β-谷甾醇（β-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、3β-乙酰氧基苍术酮（3βacetoxyatractylone）。β-谷甾醇是一种植物固醇，与胆固醇结构相似，能够参与多种细胞信号通路进程，包括细胞的凋亡、增殖、转移、炎症等［13］，且具有抗糖尿病、降血脂、抗癌等多种作用［14］。Babu等［15］实验发现β-谷甾醇与受体后胰岛素信号分子β-arrestin-2，c-Src和IRS-1以及Akt蛋白具有高亲和力，能够减弱胰岛素抵抗，减轻高脂饮食所引起的脂肪组织有害变化。豆甾醇与β-谷甾醇均为甾醇类提取物，在葡萄糖利用及肝糖原降解途径方面起到重要作用，研究表明，豆甾醇与β-谷甾醇均能够使糖异生酶及丙酮酸激酶恢复正常水平，使糖尿病大鼠的β细胞明显再生［16］。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌以及心脏保护等功能，是一种常见的饮食类黄酮化合物［17］，研究发现山柰酚能够抑制高血糖环境下NRK-52E、RPTEC细胞中RhoA的活化并降低氧化应激反应、促炎性因子的表达以及延缓纤维化形成［18］。研究表明［19］，常春藤皂苷元亦具有抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、保肝等作用，常春藤皂苷元能够抑制IL-6、TNF-α以及COX-2等促炎细胞因子的mRNA表达，且能够通过促进AKT、ERK的激活以阻止p38MAPK的激活，参与抑制细胞凋亡进程。

根据PPI网络结果显示，本研究推测真武汤治疗DKD的关键 靶点主 要包括TNF、AKT1、IL6、PTGS2、MAPK8等。既往研究发现，DKD的发病机制与炎症因子的介导关系密切［20］，本研究所得到的关键靶点中，TNF-α、IL6是参与炎症反应的炎性细胞因子，可以由脂肪细胞分泌，能够参与能量代谢、葡萄糖和脂质代谢等，在生殖、心血管以及免疫系统的调节方面起到重要作用［21］。高血糖诱导的氧化应激反应能够增加内皮细胞的损伤，增加微血管通透性，并刺激炎性细胞因子TNF-α、IL6等的分泌以促进加重炎症反应［22］。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够调节胰岛素代谢。研究表明［23，24］，AKT1是PI3K/AKT通 路 的重要因 子，PI3K/Akt细胞信号通路在调节葡萄糖稳态、脂质代谢、蛋白质合成以及细胞存活等方面起到了重要作用，且胰岛素能够通过PI3K/AKT信号通路以调节胰岛B细胞功能。PTGS2是花生四烯酸转化为前列腺素的主要酶，PTGS2诱导的前列腺素合成能够刺激细胞增殖，促进血管生成，抑制细胞凋亡并且能够增加转移潜力［25］。

KEGG通路富集分析显示，真武汤调控DKD的主要通路有hepatitis B、TNF、肿瘤信号通路等，这些通路大多参与炎症反应过程。其中hepatitis B信号通路能够参与调节细胞的分化、增殖、凋亡、细胞信号级联等［26］。TNF信号通路中的TNF是一种促炎细胞因子，在调节炎症反应等方面起到了重要作用，从而影响DKD的发病机制［22］。

综上所述，本文通过网络药理学方法，系统阐述了真武汤的活性化学成分以及其治疗DKD多靶点、多通路的机制过程，为进一步探究真武汤治疗DKD的作用机制提供了理论依据。但本文仍然存在一定的局限性，本文仅依据生物信息学等数据挖掘OB≥30%，DL≥0.18 的活性化学成分，但仍有部分化学成分未纳入数据处理，且部分化学成分未在数据库中找到对应靶点。本研究仍需进行动物或细胞实验研究，以期为真武汤治疗DKD提供更为清晰的理论依据。