连续流动-分光光度法测定加热不燃烧卷烟专用新型薄片中甲醛含量

王春琼，陈 丹，蔡洁云，张 轲，李 苓，张 燕，顾健龙，孙浩巍，曾天宝，彭丽娟**

(1. 云南省烟草质量监督检测站，云南 昆明 650106；2. 深圳市一正科技有限公司，广东 深圳 518101)

采用造纸法工艺并添加多种添加剂制备的加热不燃烧卷烟专用新型薄片，能够改变烟草中的化学组分，实现烟草原料有序加工，调控加热不燃烧卷烟烟气组分[1-2]. 作为加热不燃烧卷烟芯基材的专用原料，该新型薄片虽具有诸多优点，但在烟叶原料本身及调制加工过程中，纸基中的半纤维素、纤维素和木质素，涂布液中的水溶性糖、果胶和淀粉等前体物质会发生化学变化，产生大量甲醛，使得加热不燃烧卷烟在抽吸过程中甲醛的释放量升高[3-5]. 甲醛是一类重要有害物质，挥发性强，反应活性大，具有致癌、吸入危险、成瘾性，在加热不燃烧卷烟的抽吸过程中会不同程度地刺激人体的呼吸系统和感觉器官，危害人体健康，已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸性物质[6]. 因此，对加热不燃烧卷烟中甲醛的控制，尤其是对其进行有效检测的技术研究，对保护消费者健康安全、提升加热不燃烧卷烟质量和烟草企业的利益均有着重要意义.

目前国外烟草公司对加热不燃烧卷烟的研究大多集中在烟气成分、毒理学评价等方面[7-11]，而国内目前研究重点是通过热重和热裂解分析等方法对加热不燃烧卷烟中加热段烟草基体的热行为进行研究[12-16]，但对加热不燃烧卷烟的有害成分及其含量的研究较少，新型薄片中甲醛的测定更是未见任何公开报道. 据调研，只有一家中烟企业内部标准用高效液相色谱法测定甲醛，但该方法前处理需衍生化，操作繁琐，且仪器昂贵、检测成本高、分析周期长，较难普及，也难以满足大规模检测的需要[17-19]. 连续流动分析仪不仅设备便宜，维护成本低，且具有前处理简单，上机操作简便，检测快速，定量准确等优势[20-21]. 国内烟草行业自20 世纪80年代引进连续流动分析仪以来，已进行了烟草及烟草制品中水溶性糖、总植物碱、总氮、总挥发酸、淀粉、游离态烟碱等化学成分的检测，也有采用连续流动分析仪进行卷烟纸中氯、钾、硝酸盐等的检测[22-23]，但目前还未见有运用连续流动分析仪检测新型薄片中甲醛的报道.

鉴于此，本文基于甲醛的醛基与乙酰丙酮在线反应生成420 nm 处有吸收的显色复合物的原理，建立了测定加热不燃烧专用新型薄片中甲醛含量的连续流动-分光光度法，该方法成本低廉、前处理简单、测定快速、定量准确、检出限低，非常适合薄片企业生产质量监管的需要.

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料 样品1#、2#为云南某再造烟叶有限公司产品，样品3#、4#和5#为云南中烟技术中心加热不燃烧卷烟芯基材.

1.1.2 试剂 乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司），氨水（国药集团化学试剂有限公司），乙酰丙酮（汕头市西陇化工厂），盐酸（汕头市西陇化工厂），氢氧化钠（汕头市西陇化工厂），37%甲醛（国药集团化学试剂有限公司）. 以上试剂均为分析纯. 活性炭颗粒（中国医药（集团）上海化学试剂公司）. 乙酰丙酮试剂配制：将36.75 g 乙酸铵置于200 mL 去离子水中，待乙酸铵全部溶解后添加1.25 mL 氨水搅匀，再添加0.5 mL 乙酰丙酮，然后用去离子水稀释定容到250 mL；去离子水试剂配制：在250 mL 去离子水中加入 0.25 mL 的Brij-35，混匀.

1.1.3 仪器 METLER AE200 分析天平（感量：0.000 1 g，瑞士METLER TOLEDO 公司）；BRAN LUEBBE AA3 连续流动分析仪（德国BRAN LUEBBE 公司）；Agilent1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）JA5002 天平（感量0.01 g，上海天平仪器厂）；HS501 往复振荡器（上海化科实验器材有限公司）；Millipore AQUELIX5 纯水机（美国MERCK Millipore 公司）.

1.2 方法

1.2.1 高效液相色谱（HPLC）法 称取薄片样品1.000 0 g，加入7 mL 水浸润后，再加入55 mL 乙腈，振荡萃取30 min，取萃取液加衍生化试剂（按体积比1∶4 比例添加）进行衍生，再经0.45 μm 有机相滤膜过滤，按下述色谱条件进行测定.

色谱条件：C18 柱（150 mm×φ4.6 mm，5 μm），流速0.7 mL/min，进样量10 μL，检测波长365 nm，柱温为30 ℃，流动相A 为乙腈，流动相B 为水，洗脱梯度见表1.

表1 流动相洗脱梯度Tab. 1 Elution gradient of mobile phase

1.2.2 连续流动-分光光度法 称取剪碎的薄片样品0.500 0 g（0.5 cm×0.5 cm），加入0.01 mol/L 的氢氧化钠溶液50 mL 和1.5 g 活性炭，振荡1 h，过滤，收集滤液待用. 用连续流动分析仪进行分析，流路图见图1.

图1 分析流路图Fig. 1 Flow chart of determination

分析条件为：检测速度为30 个/h；进样与清洗时间比为1∶1；基线校正开通；漂移校正开通.

1.2.3 连续流动-分光光度法数据处理 新型薄片中甲醛质量分数按公式（1）计算：

式中：w为待测薄片中的甲醛质量分数，mg/kg；ρ为样品溶液所对应的仪器测定甲醛质量浓度，mg/L；V为萃取液体积，mL；m为碎片样品质量，g.

2 结果与讨论

2.1 分析条件优化

2.1.1 连续流动分析仪主要试剂的管路配制

通过比较样品溶液、乙酰丙酮试剂和去离子水3种试剂的不同管路配置对系列标准工作液的影响选择适宜的管路配置. 用0.01 mol/L 的NaOH溶液逐级稀释37%甲醛溶液，依次得到0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和1.0 mg/L 的甲醛标准工作液. 如表2 所示，综合考察峰形、分离度、线性所对应的最高甲醛质量分数、线性相关系数等，选择如下管路配置：样品溶液和去离子水均用用红/红泵管（流速为0.80 mL/min），乙酰丙酮用黑/黑泵管（流速为0.32 mL/min）.

表2 连续流动分析仪主要试剂的管路配置Tab. 2 Piping arrangement of main reagents for continuous flow analyzer

2.1.2 显色反应混合圈匝数的选择 显色反应在乙酰丙酮试剂加入后发生，因此通过改变乙酰丙酮试剂加入后的反应混合圈总匝数对出峰情况的影响以确定显色反应时间. 如表3 所示，当反应混合圈匝数为5、10 和15 匝时，峰的分离度不好，且线性相关系数较差. 而当反应混合圈匝数为20、25 匝时，峰的分离度都挺好，线性相关系数差异也不大，说明乙酰丙酮试剂加入后，添加20 匝反应混合圈足以完成显色反应，从缩短检测时间，提高检测效率的角度看，选择20 匝.

表3 显色反应时间的优化Tab. 3 Optimization of color reaction time

2.1.3 分析流路添加透析器的影响 新型薄片样品溶液偏黄色，而黄色在420 nm 也会有吸收，从而影响420 nm 处的吸光度测定，因此实验考虑在流路中添加透析器，稀释样品溶液，过滤大分子杂质，降低黄色干扰. 表4 为添加透析器前后1#、2#样品的加标回收率情况，结果表明流路中添加透析器后，样品与去离子水混合后从透析槽的上部进入，仅有30%的样品液能通过透析膜，进入透析槽下部流出后与显色剂反应，可有效地降低黄色样品溶液对420 nm 处的吸光度造成的假阳性干扰.

表4 流路添加透析器前/后加标回收率的对比（n=5）Tab. 4 Comparison of standard recovery rate before and after adding dialyzer to flow path（n=5）

2.1.4 活性炭用量的影响 专用薄片样品颜色深，造成样品溶液背景存在假阳性干扰，需采用活性炭对样品萃取液进行脱色处理. 取1#样品0.5 g，按1.2.2 实验方法进行样品处理，仅更改活性炭用量，考察其对样品溶液响应值的影响. 图2 表明，活性炭用量在1.5 g 以内时，随着活性炭用量的增加，仪器响应值逐渐降低，大于1.5 g 后响应值趋于稳定，故选择活性炭用量为1.5 g.

图2 活性炭用量的优化Fig. 2 Optimization of activated carbon dosage

2.1.5 振荡时间的影响 取1#样品0.5 g，按实验方法进行样品处理，仅更改振荡时间，考察其对样品溶液响应值的影响. 从图3 可知，随着振荡时间的增加，甲醛不断被0.01 mol/L 氢氧化钠溶液溶出，当振荡时间在1 h 以内时，随着振荡时间的增加，响应值逐步升高，大于1 h 后响应值趋于稳定，说明薄片中的甲醛被萃取完全，考虑到样品检测效率，振荡时间确定为1 h.

图3 振荡时间的优化Fig. 3 Optimization of oscillation time

2.1.6 振荡提取温度的优化 平行称取1#样品3 份，进行相同质量浓度加标后，分别在常温、水浴30 ℃、40 ℃和50 ℃条件下振荡1 h，其余条件相同，考察加标回收率的情况. 表5 表明，提取条件为常温时，测定结果最为准确，当温度超过30 ℃，薄片中的复杂基质溶出，造成测定波长处假阳性干扰，甚至直接超过测定上限，故实验选择为常温振荡提取.

表5 振荡提取温度的优化（n=5）Tab. 5 Optimization of oscillating extraction temperature（n=5）

2.1.7 显色剂加入量的影响 显色反应是连续流动法准确定量的关键，不同浓度显色剂对显色反应的影响也不一致，因此实验考察了不同浓度显色剂的乙酰丙酮试剂对甲醛检测的影响. 固定乙酸铵和氨水的量分别为29.4 g 和1.00 mL，改变乙酰丙酮试剂中乙酰丙酮加入量分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，绘制标准曲线，考察出峰时间和线性相关系数. 结果表明，不同条件下出峰时间均为11.5 min，但对线性相关系数影响较大，乙酰丙酮加入量为0.5 mL 时，线性相关系数为0.999 1，其余加入量条件下，线性相关系数略低（图4）.

图4 显色剂加入量的优化Fig. 4 Optimization of the dosage of chromogenic agent

2.1.8 乙酸铵-氨水缓冲体系的添加量及其pH

优化 实验依据标准工作曲线的线性相关系数、6次标准溶液（0.4 mg/L）检测值的RSD，考察了乙酰丙酮试剂中乙酸铵-氨水缓冲体系的添加量及其pH 对检测的影响. 由表6 可知，添加量2 的乙酰丙酮试剂得到的标准曲线线性相关系数最好，且标准溶液检测值的RSD 最小，因此确定乙酸铵和氨水的加入量分别为36.75 g 和1.25 mL. 由表7 可知，pH 对显色反应的影响很大，乙酰丙酮试剂中乙酸铵-氨水缓冲体系为pH=2 时，得到的标准曲线线性相关系数最好. 说明在此条件下，显色反应效果最佳，其余pH 条件下的线性相关系数，不能达到定量检测的要求.

表6 缓冲溶液加入量的优化Tab. 6 Optimization of buffer solution concentration

表7 缓冲溶液pH 的优化Tab. 7 Optimization of buffer solution pH

2.2 方法验证结果

2.2.1 检出限和定量限 在最优条件下，精确配制得到0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和1.0 mg/L 的标准工作液，所得标准工作曲线方程为：y=21.04x+0.13，相关系数r2=0.995 4；采用0.2 mg/L 标准溶液，连续进样10 次，测定结果的标准偏差为0.35 mg/kg，因此方法的检出限为3SD=1.05 mg/kg，定量限为10SD=3.5 mg/kg.

2.2.2 重复性 对5 个专用薄片样品由同一操作员按照本实验方法，在同一时段内分别平行测定3 次，结果见表8. 结果表明，本方法测定甲醛质量分 数 的RSD 值 分 别 为0.40%、 0.58%、 0.18%、0.30%和0.53%，均小于1%，重复性较好.

表8 方法重复性Tab. 8 Repeatability of the method

2.2.3 稳定性 对5 个专用薄片样品由同一操作员按照本实验方法，分别在不同时段内测定3 次，每次平行测定2 次，取平均值，结果见表9. 结果表明，本方法测定甲醛质量分数的RSD 值分别为0.50%、0.67%、0.28%、0.71%和0.32%，均小于1%，稳定性较好.

表9 方法稳定性Tab. 9 Stability of the method

2.3 样品检测结果将5 个薄片样品用该实验方法进行甲醛的检测，并进行加标回收实验. 结果表明（表10），连续流动法测定结果的加标回收率为95.5%～110.0%，初步说明测定结果准确、可靠.

表10 样品测定及加标回收率（n=3）Tab. 10 Results of determination of formaldehyde in samples（n=3）

为进一步验证连续流动的测定结果，采用HPLC 法测定5 个薄片样品中的甲醛，结果见表11.通过T 检验比较两组数据，P＞0.05，说明在95%置信度下，两种方法测定结果无显著性差异. 可见，本方法与HPLC 法的一致性较好.

3 结论

随着加热不燃烧卷烟风靡市场，薄片企业生产厂都纷纷增加了新型薄片生产线，各种类型的新型薄片产品问世，国内外市场对薄片安全指标也提出了更高要求. 甲醛沸点低，易挥发，在加热不燃烧卷烟抽吸时，对人体的安全隐患不容忽视. 本工作建立的方法具有成本低廉、前处理简单、测定快速、定量准确、检出限低等优点，具有较高的实用价值，样品只需加入水和活性炭振荡提取后过滤，便可直接上机测定，每小时可测30 个样品，非常适合薄片企业生产质量监管的需要.