免疫亲和柱净化-HPLC光化学柱后衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1的含量

◎ 尹安胤

（云南省德宏州质量技术监督综合检测中心，云南 德宏 678400）

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，种类繁多，常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）分布最广、毒性最强、危害最大。AFB1主要污染粮油类食品，如花生、玉米、大米等，其中以花生和玉米污染最为严重[1]。1993年国际癌症研究机构（IARC）已将AFB1定为I类致癌物，AFB1是目前最强的致癌化学物质之一，人体长期摄入含AFB1的食品会诱导肝癌等多种癌症的产生，对健康造成巨大威胁，在历年的《国家食品安全监督抽检实施细则》中都将其列为重点检测项目。

在《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中规定了玉米及其制品中AFB1的限量值为20 μg·kg-1[2]。目前我国对食品中AFB1的检测主要以《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）的规定为主[3]，标准中规定了AFB1检测的液相色谱串联质谱法、高效液相色谱（柱前、柱后衍生）法、酶联免疫吸附筛查法和薄层色谱法。其中，薄层色谱法操作复杂、步骤烦琐、灵敏度低，属于半定量方法，且试剂消耗较大，会对检测人员身体健康造成较大危害[4]；酶联免疫吸附筛查法实验影响因素较多，容易出现假阳性，可靠性较差，无法实现精确定量，主要用于大批量样品的筛查；液相色谱串联质谱法虽然检测灵敏度在几种方法中最高，但设备昂贵、检测和维护成本高且对检测人员要求较高，在基层实验室很难得到应用；高效液相色谱法具有灵敏度高、准确度高、操作简单、检测和维护成本较低等优点，因此仍为目前AFB1检测的首选方法。本文采用免疫亲和柱净化-HPLC光化学柱后衍生法建立一种快速、准确检测玉米中AFB1的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪-荧光检测器，岛津LC-20A、RF-20A；光化学衍生器，北京华安麦科生物科技有限公司；水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司；BS1254电子天平，德国赛多利斯股份有限公司；Maxi Mix Ⅱ涡旋振荡器，赛默飞世尔科技有限公司；超纯水机，密理博中国有限公司；0.22 μm针式滤膜，天津津腾实验室设备有限公司；玻璃纤维滤纸（WHATMAN 1827-110），上海根生生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），默克化工技术（上海）有限公司；AFB1免疫亲和柱（3 mL），北京华安麦科生物科技有限公司；甲醇中 AFB1标准溶液（20 μg·mL-1），默克 Supelco。

1.2 实验样品

玉米粉中黄曲霉毒素B1质控样品，购自坛墨质检标准物质中心。

1.3 色谱条件

色 谱 柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；流动相：甲醇∶水（45∶55）；进样量：10 μL；荧光检测器激发波长：360 nm，发射波长：450 nm。

1.4 提取与净化

准确称取10 g（精确到0.01 g）混合均匀的样品于250 mL具塞碘量瓶中，加入2 g氯化钠与100 mL提取液（70%甲醇-水溶液）混匀，置于摇床上以200 r·min-1剧烈振荡20 min，用快速定性滤纸过滤并收集滤液，取10 mL滤液于小烧杯中并加入10 mL去离子水稀释，再用玻璃纤维滤纸过滤，并收集滤液作为待净化液。

取出免疫亲和柱并使其恢复至室温，连接10 mL注射器筒并固定在气控操作架上，取10 mL待净化液注入注射器筒中，去掉亲和柱下方堵头，调节气流，使液体以1～2滴/s的速度流出，待液体排干后，用10 mL去离子水以2～3滴/s的流速洗涤2次，待液体排干后，用气流吹去残留液滴，加入1 mL甲醇以1滴/s的流速洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度离心管中并定容至1 mL。洗脱液用0.22 μm针式滤膜过滤至色谱进样小瓶中供液相色谱测定，与标准系列比较，外标法定量。

1.5 标准曲线的绘制

准确吸取 AFB1标准溶液（20 μg·mL-1）0.1 mL 于25 mL棕色容量瓶中并用乙腈定容，配制成80.0 ng·mL-1的中间液，再用乙腈稀释得到 2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL、40.0 ng·mL-1和 80.0 ng·mL-1的标准系列工作溶液。将工作溶液注入液相色谱中，按照1.3中的色谱条件进行测定，以标准系列工作液的浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，得到标准曲线回归方程。AFB1的标准色谱图见图1，标准曲线见图2。试样中AFB1含量按公式（1）和（2）计算：

图1 AFB1标准色谱图

图2 AFB1标准曲线图

式中，X-试样中AFB1的含量，μg·kg-1；m-称取试样质量，g；c-进样溶液中AFB1在标准曲线上对应的浓度，ng·mL-1；V-样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，mL；f—稀释倍数；V1-加入的提取液体积，mL；V2-稀释用样品滤液的体积，mL；V3-加入稀释液的体积，mL；V4-注入免疫亲和柱的待净化液体积，mL。

本实验中稀释倍数f=20，保留时间为16.7 min，经计算得试样中 AFB1含量为 17.2 μg·kg-1。

2 结果与分析

2.1 免疫亲和柱的应用

本文采用免疫亲和柱进行净化处理。AFB1免疫亲和柱的原理是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品中的AFB1经过提取、过滤、稀释后缓慢通过AFB1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内AFB1与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他杂质。最后用甲醇洗脱AFB1供液相色谱上机检测。免疫亲和柱可选择性地吸附样品提取溶液中的AFB1，从而对样品提取溶液起到针对性的纯化作用[5]。免疫亲和柱净化法样品色谱图杂峰较少、峰型对称、基线平稳（图3），回收率高，样品净化过程操作较为简单快速，可有效提高检测方法的灵敏度和准确度。

图3 免疫亲和柱净化后样品色谱图

2.2 光化学柱后衍生的效果

由于AFB1在水溶液中会发生荧光淬灭，在进行高效液相色谱法测定前要进行衍生化处理[6]。在《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）中规定了柱前衍生和柱后衍生两种衍生方法。柱前衍生法操作过程烦琐，衍生化过程中易引入杂质和干扰峰，可能造成目标化合物的损失。本文采用柱后光化学衍生法，该法操作简单，设备成本低，只需在柱后连接光化学衍生器，通过紫外光照射可使样品溶液中的AFB1荧光特性显著增强，从而有效提高方法的灵敏度。

2.3 线性范围、相关系数和检出限

本实验中AFB1浓度在2.5～80.0 ng·mL-1范围内呈良好线性关系，AFB1的标准曲线回归方程为Y=2.08×10-5X+0.411，相关系数r=0.999 9。随试样同时做空白试验，以3倍信噪比计算出检出限为0.05 μg·kg-1。

2.4 精密度与回收率实验

选取一个加标样品按照免疫亲和柱净化法处理后重复测定6次，根据AFB1峰面积计算出相对标准偏差（RSD），结果见表1。从由表1数据可知，RSD为2.17%，表明该方法精密度良好。

表1 精密度试验结果表

用已知AFB1含量的玉米粉样品制备3个添加水平的加标样品：5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1，每个水平制备6个平行样，按照免疫亲和柱净化法处理后上机测定，分别计算回收率和RSD，结果见表2。从表2数据可知，3个添加水平下的平均回收率为88.5%～94.3%，RSD为1.96%～2.57%，表明该方法的准确度良好。

表2 回收率试验结果表

3 结论

本文建立了玉米中AFB1的免疫亲和柱净化-HPLC光化学柱后衍生测定方法，免疫亲和柱能选择性地识别和富集AFB1，光化学柱后衍生能够显著增强AFB1的荧光特性，可有效提高灵敏度，样品加标回收率为88.5%～94.3%。该方法具有操作简便、快速、稳定性好、回收率高等优点，能够满足玉米及其制品中AFB1含量的快速测定需求。