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免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中维生素B12

2018-04-04余以刚黄焯枝郭文婷郭伟鹏

中国食物与营养 2018年3期
关键词:色谱法液相饮料

周 黎,余以刚,徐 红,黄焯枝,郭文婷,郭伟鹏

(1华南理工大学,广州 510006;2达能(中国)食品饮料有限公司,广州 510000;3省部共建华南应用微生物国家重点实验室,广州 510070;4广东省微生物研究所,广州 510070;5广东省微生物分析检测中心,广州 510070)

我国对维生素B12的允许添加量有明确的规定[1-2],其中饮料类产品的允许添加量为0.6~1.8μg/kg。目前检测维生素B12的方法主要有微生物法[3]、原子吸收法[4]、高效液相色谱法[5]等。其中,微生物法具有工作效率低、操作复杂、成本较高的缺点;原子吸收法由于受基质影响,检测结果不准确,特别是分析含量低的样品;高效液相色谱法具有操作简单、分析准确等优点,但是对于成分复杂、维生素含量低的样品难以进行定量或者定性分析,因此本检测方法采取对高效液相色谱法进行改进,将超高效液相色谱法结合免疫亲和柱对样品进行分析,免疫亲和柱对维生素B12具有较高的选择性,可以对样品维生素B12进行纯化和富集,再经超高效液相色谱法检测样品从而达到分析准确、快速、成本低、操作简单的目的。因此,将免疫亲和柱—超高效液相色谱法运用到成分复杂的饮料中低含量维生素B12的测定具有重大的意义。

1 试验与材料

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(美国Waters公司);超声波清洗仪,美国Auto science公司;氮吹仪,中国安谱公司;固相萃取仪,美国CNW公司;超纯水机,美国Millipore公司;维生素B12标准品,99.9%,美国supelco公司;免疫亲和柱,德国拜发公司;甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸,色谱纯,美国CNW公司;乙醇,分析纯,广州化学试剂厂。

1.2 色谱条件

色谱柱HSS T3(2.1mm*75mm,1.8μm,流动相为乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱,柱温35℃,进样量50μL,流速0.6 mL/min,检测波长360nm,洗脱溶剂A相为乙腈,B相为0.1%甲酸,梯度洗脱参数如表1所示。

表1 流动相梯度时间、流速与比例参数

1.3 样品前处理

1.3.1标准溶液的配制维生素B12的标准储备液:称取维生素B12标准品12.0mg溶于5%的乙醇溶液中,用50mL棕色容量瓶定容,混匀后备用。取1mL标准储备液用水稀释至250mL棕色容量瓶中,得到维生素B12的标准中间溶液,再分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL标准中间溶液用水稀释至1 000mL棕色容量瓶中,得到维生素B12的标准溶液,现配现用。

1.3.2免疫亲和柱纯化和富集取25mL维生素饮料进样到真空处理除去缓冲液的免疫亲和柱上,用10mL超纯水淋洗后,真空抽干残留液使亲和柱干燥,再用3mL甲醇溶液反冲洗3次(1次反冲洗用1mL甲醇,共3次)。洗脱时控制为1滴/秒的流速滴到试管中,于60~70℃下用氮气吹干洗脱液,再用0.3mL 0.025%三氟乙酸溶液溶解后得到的溶液用于上机分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理净化柱的选择

维生素饮料经免疫亲和柱和Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱纯化后得到的图谱如图1和图2所示。经免疫亲和柱过滤后的图谱相比WatresSep-Pak C18(500mg/6cc)柱过滤后的图谱显示出更好的分离效果,基线平稳且维生素B12出峰无干拢,杂质少。因此,为了对维生素饮料中B12进行定性与定量的分析,选择免疫亲和柱过滤纯化后得到的样品进行后续测定。

图1 维生素饮料经免疫亲和柱过滤后的色谱图

图2    维生素饮料经Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱过滤后的色谱图

2.2 洗脱过程中甲醇量的选择

采用4种洗脱方法进行比较确定洗脱过程中最佳的甲醇量:(1)3mL甲醇洗脱1次;(2)1mL甲醇洗脱1次;(3)分别取3次1mL甲醇洗脱3次;(4)分别取3次1mL甲醇反复来回抽到针筒洗脱3次样品。以上4种洗脱方法速度均为1滴/秒,结果表明,4种洗脱方法的回收率分别为82.1%、65.2%、88.2%、94.3%,故选择第4种方法比较理想。

2.3 洗脱过程中pH的选择

如图3所示,pH7.0条件下经免疫亲和柱富集纯化后样品的维生素B12的含量为0.16μg/100mL左右,而pH3.0条件下经免疫亲和柱富集纯化后样品的维生素B12的含量为0.12μg/100mL左右。结果表明,pH7.0条件下更有利于免疫亲和柱对维生素B12的富集和洗脱,因此选择调整维生素饮料的pH为7.0时进行免疫亲和柱富集和洗脱。

图3    维生素饮料在pH 3.0和pH 7.0条件下经免疫亲和柱洗脱后维生素B12含量的变化情况

2.4 样品的保存与分析

将同一批次生产的维生素饮料分别于20℃、45℃和日光灯条件下存放1个星期,所测得的维生素B12含量结果见表2。不同条件下放置的样品维生素B12的含量依次为20℃>45℃>日光灯,表明光照以及高温会加速维生素B12的分解,因此含有维生素B12的维生素饮料更适合在20℃室温与避光条件下存放。

表2维生素饮料的维生素B12含量单位:μg/L

条件20℃45℃日光灯含量145125113

2.5 线性关系及回收率实验

在浓度为0.4~10μg/L内测定维生素B12的标准曲线,所得的线性回归方程为Y=4 040X-364,相关系数为0.997 00,显示出较好的线性关系。同时对样品进行含量分析,在已知浓度的样品中加入标准溶液重复测定4次,加入值为30.1μg/L时,测定值为28.5μg/L,所得回收率为94.68%,检出限为0.1μg/L,显示出较高的准确性。表明运用免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中低浓度维生素B12的含量是非常准确可靠的。

2.6 系统精密度试验

同一瓶维生素饮料,在1d内连续测定6次,其精密度数据如表3所示,维生素B12的峰面积的RSD为0.65%,精密度良好。说明免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中低浓度维生素B12的含量具有较高的精密度,因此该方法应用到维生素饮料中低浓度维生素B12的含量测定是切实可行的。

表3 样品精密度

3 结论

针对维生素饮料中成分复杂、维生素B12含量很低的特点,直接采用超高效液相色谱法测定维生素B12很难对其进行定性或定量的分析,因此本研究建立了免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中B12的方法。由于免疫亲和柱对维生素B12具有很高的选择性,可以有效的去除杂质的干扰,对维生素B12进行纯化。同时根据仪器与色谱柱的特性,采用乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脱样品,具有较好分离效果,基线稳定。结果表明,采用免疫亲和柱—超高效液相色谱法测定维生素饮料中维生素B12具有较高的回收率为94.68%,且检出限低至0.1μg/mL。因此该检测方法非常适用于成分复杂、结构复杂、维生素含量低的饮料中维生素B12的测定,相比传统的高效液相色谱法具有工作效率高、分析时间短且更准确的优点。◇

[1]吴楠,姜金斗,等.免疫亲和柱净化/高效液相色谱法测定乳粉中B12的含量[J].分析测试学报,2013,32(3):389-392.

[2]中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2011.

[3]中华人民共和国卫生部.GB 5413.14-2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.

[4]李妹.紫外吸光光度法测定维生素B12[J].理化检验(化学分册),2005,41(1):53-54.

[5]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.217-2008保健食品中维生素B12的测定[S].北京:中国标准出版社,2008.

[6]姜学群.高效液相色谱法测定维生素B12片的含量[J].咸宁学院学报(医学版),2010,24(1):70-72.

[7]高旭.高效液相色谱法同时测定食品中8种水溶性维生素[J].中国医药指南,2008,6(19):36-39.

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