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适用于单细胞RNA测序的半月板细胞提取方法的优化

2021-10-14陈纳淳吴汉森邓仲豪廖哲霆冯舒皓骆梓恒楚玉豪邱耿韬李啸宇戎圣炜王富华陈如歌

南方医科大学学报 2021年9期
关键词:单细胞悬液半月板

陈纳淳,吴汉森,邓仲豪,廖哲霆,冯舒皓,骆梓恒,楚玉豪,邱耿韬,李啸宇,金 昱,戎圣炜,王富华,甘 露,陈如歌,赵 亮

1南方医科大学南方医院骨科-关节与骨病外科,广东 广州 510515;2南方医科大学珠江医院院办,广东 广州510080

半月板损伤或者半月板衰退会导致膝关节失稳,进而导致骨性关节炎(OA)的发生[1],半月板的胶原纤维含量是其体质量的28%,这些胶原纤维相互交织形成胶原纤维网,为其细胞的附着提供基础架构[2-4]。在膝关节骨性关节炎患者中,退变的半月板胶原化和钙化程度增加,细胞密度降低[5]。这对提取退变半月板中的细胞造成了困难。单细胞RNA测序技术能在单细胞层面检测细胞间的异质性[6-9]。其高灵敏度能发现半月板组织中少量存在且未被发现的前体细胞亚群,为半月板损伤修复提供新的研究方向。

市面上使用最多的单细胞RNA 测序技术由10×Genomics 公司推出,对单细胞悬液的质量具有十分严格的要求——细胞悬液中含有超过1×105细胞,其中80%是活细胞,而且不能含有细胞外基质及细胞残骸。传统的半月板细胞提取方法无法获得上述细胞悬液。报道最多的半月板细胞提取方法是使用胶原酶消化半月板组织10 h 以上[10-12],但无法获取足够数量的活细胞。叶川团队[13]尝试使用阶段消化法提取人胚半月板细胞,虽然细胞活率高,但总消化时间达18 h。Sun团队[14]曾尝试在半月板细胞上运用单细胞RNA测序技术,但没能够获得符合要求的新鲜单细胞悬液。如果细胞在离体环境中存活时间过长,其基因表达会发生改变[15-17]。

鉴于上述原因,本文介绍了一种简单、可重复而且耗时短的半月板细胞提取方法。用此方法进行3次重复实验以验证其有效性,并对获得的3份细胞悬液分别进行单细胞RNA测序前评价和测序后评价。通过数据分析结果来评价优化提取法的稳定性和可靠性。

1 材料和方法

1.1 组织样本

本文所用的半月板均来源于进行膝关节表面置换术的膝关节骨性关节炎患者。当半月板被切除后立即将半月板保存于无菌的4 ℃磷酸缓冲液(PBS)中,并在30 min内将半月板送至实验室。来源于小鼠,大鼠及猪的半月板也能通过此方法进行半月板细胞的提取。

1.2 主要材料

1.2.1 器械 锋利的手术刀片及手术刀柄,2把锋利的直眼科剪(12.5 cm),培养皿(100 mm×15 mm)、离心管(50 mL),巴斯吸管(3 mL),移液枪及吸头(P1000,P200,P100,细胞筛网(40 μm;蓝色),针式过滤器(0.22 μm),注射器(10 mL,20 mL),细胞计数板(Countstar)。

1.2.2 生物试剂 胎牛血清(FBS),磷酸缓冲液(1X)(PBS),基础培养基(α-MEM)和青霉素-链霉素混合溶液(P/S)(Gibco),死细胞去除试剂(Miltenyi Biotec)。

1.2.3 消化酶 链霉蛋白酶,Ⅰ型胶原酶,Ⅱ型胶原酶(Sigma)。

1.3 溶液配制

1.3.1 细胞悬液缓冲液 将50 mL FBS 和5 mL P/S溶液加入至500 mL α-MEM溶液中,放置在4 ℃环境中保存,保持无菌。此种溶液最长可保存1月。

1.3.2 链霉蛋白酶溶液 此种溶液需要在使用前配制。将450 mg链霉蛋白酶加入至50 mL α-MEM中,配制成浓度为9 mg/mL的链霉蛋白酶溶液,经针式过滤器过滤后放置在4 ℃环境中保存,保持无菌。

1.3.3 I型胶原酶和II型胶原酶混合液(I/II混合液)此种溶液需要在使用前配制。将10 mg I型胶原酶和10 mg II型加入至50 mL 细胞悬液缓冲液中,配制成浓度为0.2 mg/mL的I/II混合液,经针式过滤器过滤后放置在4 ℃环境中保存,保持无菌。

1.4 方法

1.4.1 消化前处理 半月板切除后立即保存于无菌的4 ℃磷酸缓冲液(PBS)中,并在30 min内送至实验室。放在装有4 ℃PBS的培养皿中,用手术刀和眼科剪剔除黏附于半月板周围的滑膜组织,用10 mL 4 ℃PBS冲洗2~3 次,冲洗干净后放置于另一个培养皿中,加少量4 ℃PBS维持湿润。用手术刀将半月板切成碎块,称取3 g组织置于另一个培养皿,加少量4 ℃PBS维持组织湿润,用眼科剪剪碎至1 mm。以上操作过程均在碎冰上进行(图1)。

图1 优化半月板细胞提取法实验流程图Fig.1 Flow chart of the optimized protocol based on mechano-enzymatic dissociation of the meniscus.The meniscus is removed and cut into small pieces using a scalpel and then minced with sharp scissors (A,B).The tissue is then dissolved in pronase solution (C),incubated at 37 ℃and shaken mechanically (D).After centrifugation at 1000 r/min for 5 min,the supernatant is discarded(E),and the pellets are dissolved in I/II collagenase solution(F),incubated at 37 ℃and shaken mechanically(G).The sample is passed through a strain with the help of the sterile transfer pipettes(H).The suspension is centrifuged at 1000 r/min for 5 min twice and the supernatant is discarded(I).The single-cell suspension is ready for subsequent analyses(J).

1.4.2 消化 把半月板组织碎块均匀分成6份,分别放入6 支50 mL离心管内,随机分成3组,分别是优化提取组,传统法-短时间组和传统法-长时间组。优化提取组:1.5 h链霉蛋白酶和3 h I型和II型胶原酶消化(Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase),传统法-短时间组:4 h I 型和II 型胶原酶消化(4 h I/II collagenase),传统法-长时间组:10 h I型和II型胶原酶消化(10 h I/II collagenase)(表1)。

表1 优化提取法、传统法-短时间消化和传统法-长时间消化的比较Tab.1 Comparison of the optimized protocol,short-time digestion and long-time digestion

分别往3组离心管内加入25 mL I型和II型胶原酶溶液、I型和II型胶原酶溶液和链霉蛋白酶溶液,轻轻摇晃离心管,避免气泡产生。待半月板组织碎块与消化溶液充分混合后,将离心管放置于37 ℃的水浴锅中消化,每10 min摇晃1次。分别消化4、10和1.5 h。消化1.5 h后,将第3组(优化提取组)的离心管以1000 r/min 转速离心5 min,去除上清液后加入25 mL I/II胶原酶混合溶液,轻轻摇晃离心管,避免气泡产生。待半月板组织碎块与I/II胶原酶混合溶液充分混合后,将离心管放置于37 ℃的水浴锅中消化,每10 min摇晃1次。消化3 h。

1.4.3 消化后处理 待各组消化到预设时间,取细胞筛网置于退去盖帽的离心管上,构成过滤装置,将离心管中的组织悬液倒入筛网中进行过滤,用巴斯吸管搅拌辅助过滤,收集过滤后的液体。以1000 r/min 转速对滤液进行5 min的离心,去除上清液,加入10 mL细胞悬液缓冲液重悬细胞。再以相同的转速离心5 min。去除上清液,加入10 mL细胞悬液缓冲液重悬细胞,取出20 μL细胞悬液进行细胞计数,分别计算活细胞数,死细胞数和总细胞数,并在显微镜下观察。此步骤进行3次并计算各组平均活细胞数、平均死细胞数和平均总细胞数,计算细胞活率。细胞活率计算公式如下:细胞活率=平均活细胞数/平均总细胞数×100%。

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1.4.4 单细胞RNA测序及单细胞测序数据分析 用优化提取法获取3份半月板单细胞悬液,去除死细胞后用10×Genomics平台的单细胞RNA测序技术进行单细胞RNA测序。

1.4.5 分析基于优化提取法的单细胞RNA测序数据集分析基于优化提取法的单细胞RNA测序数据集时,对3个数据集的分析是分开进行的。将这3个数据集命名为Sample1,Sample2和Sample3,并按照相同的流程进行分析。

按照Seurat 官方网站(https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html)提供的分析流程,使用R包“Seurat”对各数据集进行分析。首先分别统计总的细胞数量、线粒体含量为25%的细胞数量和线粒体含量为20%的细胞数量。之后对数据集进行质控,设定细胞纳入标准:nFeature_RNA>400,nFeature_RNA<2500 和线粒体含量低于20%。筛选出符合要求的细胞进行下游分析。选择MCAM,COL1A1,CD34 这3 个细胞特征,观察其在细胞群中的分布。使用ggplot2进行绘图。

1.4.6 整合分析公开的数据集和基于优化提取法的单细胞RNA测序数据集 从Gene Expression Omnibus Dataset下载公开的半月板单细胞RNA测序数据集(GSE133449)。首先对各个数据集进行质控,设立统一的纳入标准是:nFeature_RNA>400,nFeature_RNA<2500和线粒体含量低于5%。筛选出符合要求的细胞进行数据整合。按照Seurat 官网(https://satijalab.org/seurat/archive/v3.1/integration.html)提供的数据集整合流程,将公开的半月板单细胞RNA 测序数据集和基于优化提取法的单细胞RNA测序数据集进行整合并去除批次效应。之后进行下游分析。使用的软件包信息R:version 3.63;Seurat:version 3.15;ggplot2:version 3.03。

2 结果

2.1 不同细胞提取方法获取的有效性评价

消化结束后,对各组剩余的半月板组织进行观察。使用优化提取法(1.5 h链霉蛋白酶和3 h I/II胶原酶)消化后,半月板组织碎块的体积更小,说明优化提取法能更加充分消化半月板组织(图2)。

图2 对使用不同方法消化后剩余的半月板组织进行观察Fig.2 Observation of the remaining meniscus tissues from different extraction protocols after digestion.(Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase,Traditional protocol-short time digestion:4 h I/II collagenase,Traditional protocol-long time digestion:10 h I/II collagenase).

在显微镜下对各组细胞悬液进行观察,优化提取法获得的细胞悬液细胞密度最高,而且多个视野中均未发现明显细胞外基质及细胞残骸(图3)。图3 显微镜下对使用不同提取方法获得的细胞悬液进行观察(优化提取法组:1.5 h链霉蛋白酶和3 h I/II型胶原酶,传统法-短时间组:4 h/II型胶原酶,传统法-长时间组:10 h I/II型胶原酶)在进行细胞计数后,使用优化提取法获得的细胞悬液中细胞数量及细胞活率最高。在3次实验中,使用优化提取法分别提取出2.40×105,1.64×106,6.91×105细胞,平均获得8.57×105细胞(图4)。其中活细胞个数分别是2.05×105,1.33×106和5.79×105,平均活细胞个数是7.05×105。进行细胞活率计数后发现,优化提取组细胞悬液的细胞活率均在80%以上(分别是85.6%,81.5%和83.8%),高于传统方法组(长时间组和短时间组)细胞悬液的细胞活率。

图3 显微镜下对使用不同提取方法获得的细胞悬液进行观察Fig.3 Observation of the single-cell suspension prepared using different extraction protocols under microscope.(Optimized protocol:1.5 h pronase+3 h I/II collagenase,traditional protocol-short time digestion:4 h I/II collagenase,traditional protocol-long time digestion:10 h I/II collagenase).

图4 不同提取方法获得的单细胞悬液细胞计数柱状图Fig.4 Cell counting of single-cell suspensions prepared using different extraction protocols.

2.2 优化提取法稳定性评价

用优化提取法获得的半月板单细胞悬液后,利用10×Genomics平台的单细胞RNA测序技术进行测序,通过分析3个单细胞RNA测序数据集对优化提取法进行稳定性评价。

首先对数据集进行整体观察。进行单细胞RNA测序后,每个样本分别获得8257、11 945和21 199个细胞的RNA测序数据(图5A)。其中,每个样本大部分细胞的线粒体基因含量较低。在3个样本中,线粒体基因含量低于20%的细胞数量分别是8146,10 983 和19 887个(图5B),各占相应样本总细胞数量的95.36%,75.13%和83.51%(图5C)。3 个样本平均含有13 005个线粒体基因含量低于20%的细胞,占总平均细胞数的83.06%。之后进行数据质控,将线粒体基因含量低于20%设为纳入标准,筛选符合要求的细胞进行下游分析。从t-SNE图中看出,3个细胞悬液样本中的细胞均可分成6个细胞亚群(图6A~C)。其中,3个样本中都含有COL1A1+细胞,MCAM+细胞和CD34+细胞。

图5 优化提取法稳定性的评价Fig.5 Evaluation of the stability of optimized protocol.Violin plots showing proportion of mitochondrial genes expression of each sample(A).Bar graphs showing the number of cells with mitochondrial genes below 25%and 20%(B)and the percentage of cells with less than 20%mitochondrial genes(C)in each sample(95.36%,75.13%,83.51%and 83.06%respectively).

图6 每个半月板样本的细胞亚群(6个细胞亚群)t-SNE图谱和COL1A1+、MACM+及CD34+细胞在t-SNE图上的分布Fig.6 Six meniscus cell clusters and COL1A1+,MCAM+ and CD34+ meniscal cell markers shown in t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) map of each sample.A:Sample 1 (including 8146 cells);B:Sample 2 (10983 cells);C:Sample 3(19887 cells).

2.3 优化提取法的可靠性评价

表2 优化提取法和培养提取法比较Tab.2 Comparison of optimized protocol and control protocol

经过批次效应的去除和标准的单细胞RNA数据集整合后,从t-SNE图上看,整合后数据集中的细胞分布均匀,并且可以发现,在两个数据集中存在转录组特征相同的细胞(图7A)。整合的细胞群共分6个细胞亚群(图7B)。结合两图可知,两种方法获得的细胞类型相同。从细胞亚群特异性标志物角度(图8)观察,与培养提取法一致,优化提取法也能捕获到COL3A1+细胞,COL1A1+细胞,MYLK+细胞,BMP2+细胞,CD93+细胞和CDK1+细胞。

图7 优化提取法和培养提取法获得的单细胞RNA转录数据集比较Fig.7 Comparison of single-cell RNA transcription datasets obtained by optimized protocol and control protocol.Merged t-distributed stochastic neighbour embedding (t-SNE) of single-cell RNA sequencing of cells harvested from optimized protocol and control protocol (A).6 meniscus cell clusters at t-SNE of integrated dataset(B).

图8 COL3A1,COL1A1,MYLK,BMP2,CD93和CDK1分别在两个数据集的表达Fig.8 Expression of COL3A1,COL1A1,MYLK,BMP2,CD93 and CDK1 in two datasets[Optimized protocol(left),control protocol(right)].

3 讨论

退变的半月板胶原化程度增高及细胞密度降低是造成半月板单细胞提取困难的主要原因。既往的研究表明,提取细胞依赖I型胶原酶和II型胶原酶的长时间消化,消化时间长达10~16 h[10-12]。仅仅通过延长胶原酶消化的时间并不能大幅度地提高细胞提取量[18]。长时间处于胶原酶消化液的环境中,细胞可能会被损伤甚至死亡。叶川团队[13]尝试阶段消化法分离人胚胎半月板细胞,虽然获得了高活力的细胞悬液,但需耗时18 h。胚胎半月板的细胞活力高,而退变半月板的细胞活力相对较低。暂无研究表明此种方法适用于提取退变半月板中的细胞。分阶段提取半月板细胞难以保证细胞状态的一致,影响后续单细胞RNA测序数据的准确性和可靠性。一些研究者也报道了利用胶原酶消化3~4 h进行半月板细胞提取[19,20],然而却没有详细描述细胞悬液中的杂质。我们在进行实验探索时发现,胶原酶消化3~4 h后获得的细胞悬液中含有大量胶原颗粒及细胞残骸。这些杂质比细胞小,使用10×Genomics平台进行单细胞测序时,杂质阻塞微液滴通道,导致无法捕获细胞;此外,细胞外基质和细胞残骸也含有RNA信息,会给随后的数据分析带来干扰。

Sanchez-Adams等[18]最先报道了联合使用链霉蛋白酶和胶原酶进行半月板细胞提取并有效地从牛的半月板中提取出半月板细胞;Sun 团队[14]证明了联合使用链霉蛋白酶和胶原酶在提取人类半月板细胞时同样起作用,但却没能够获得新鲜的半月板单细胞悬液进行10×Genomics平台的单细胞RNA测序。

与先前报道的半月板细胞提取方法相比,本实验方案对半月板细胞提取过程的几处关键步骤进行了改进,从而能够更快(5.5 h)地获得新鲜的半月板单细胞悬液进行单细胞RNA测序。首先,我们建立一条从手术室到实验室的快速通道,在半月板离体后30 min即可开展实验。其次,由于半月板十分坚韧,只靠眼科剪将半月板剪碎的效率低下,于是我们先采用手术刀将半月板切成小碎块,之后使用眼科剪将半月板组织碎块剪碎至1 mm大小,整个过程仅需花费15~20 min。最后,通过优化链霉蛋白酶和胶原酶消化的时间,大大提高半月板细胞提取的效率。

链霉蛋白酶消化之后,组织悬液中充满了絮状物,但尚不清楚链霉蛋白酶与半月板发生作用。据文献报道,链霉蛋白酶能与多种蛋白质发生作用并将其分解成氨基酸[21,22]。Lee等[23]证实了链霉蛋白酶能将成团的细胞群分散成一个一个细胞,然而,我们并没有在链霉蛋白酶消化后的组织悬液中找到细胞,可能链霉蛋白酶将半月板组织内致密的胶原纤维变得松散,让I型和II型胶原酶更容易将半月板细胞提取出来,机制仍需进一步探索。

在对单个单细胞RNA测序数据进行分析时,3个基于优化提取法的单细胞RNA测序数据集中的细胞都分成6 个亚群,都存在COL1A1+,MCAM+和CD34+细胞[24-26],数据结果具有一致性,说明优化提取法具有很好的稳定性。

在进行两个或多个单细胞RNA测序数据比较分析时,由于批次效应的存在使实验获得的数据存在不同程度的误差[27-29]。不能简单地将两个或多个单细胞RNA数据集组合分析。批次效应是测量结果中的一部分,因为实验条件的不同而具有不同的表现形式,并且与研究的变量没有任何关系。一般批次效应可能在下述情形中出现:实验的不同部分在不同时间完成;实验的不同部分由不同的人完成;试剂用量、芯片、实验仪器不同;将测得的数据与从数据库下载的数据混合比较。批次效应的存在掩盖了单细胞RNA测序数据的真实性,给下游分析和结果的呈现带来的影响。

在本文中,比较优化提取法和培养提取法获得的单细胞RNA测序数据时也存在明显的批次效应。因此要进行批次效应的去除。去除批次效应的方法有很多种,本文采用了锚定整合法[30],这种方法综合了基于CCA降维[31]和MNN搜索互近邻的方案[27],利用两个或多个独立单细胞RNA测序数据集中存在的少部分属于同一细胞类型的数据点对整个数据集进行“锚定”进而整合多个数据集,经整合后批次效应得到去除,同时真实生物学效应也能得到很好的保留[32,33]。

t-SNE是一种用于降维的机器学习算法,它能将高维度数据降维到二维并进行可视化。降维后数据的主要特征得到保留。在高维空间中距离接近的点,它们的特征十分接近,进行t-SNE降维后,这些点在低维度空间中仍然接近。在t-SNE图中,一个点往往代表一个细胞,并且点的距离越接近,细胞的转录组特征越相近。从图7A,B上看,两组数据集充分混合,整合后的数据均匀地分布于6个细胞亚群中,并且存在转录组特征相同的细胞,一定程度上说明批次效应得到矫正,两组数据具有可比性。

Sun等[14]通过分析基于培养提取法的单细胞RNA测序数据发现并验证半月板中存在COL3A1+细胞,COL1A1+细胞,MYLK+细胞,BMP2+细胞,CD93+细胞和CDK1+细胞。本研究与该分析结果一致,基于优化提取法的单细胞RNA测序数据中也存在相同的细胞,说明优化提取法具有可靠性。

综上所述,本文介绍的半月板细胞提取新方法稳定、可靠,具有可重复性,并且能够在短时间内获取高质量的半月板细胞悬液,为深入研究半月板细胞种类及探寻半月板干细胞提供可参考的实验方法。

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