干扰长链编码RNA FOXCUT 能抑制鼻咽癌细胞上皮间质转化及诱导线粒体损伤

高莉莉，张 雄，窦思雨，岳小丁，杨捷玲

1西京学院医学院，陕西 西安 710000；2陕西中医药大学附属医院耳鼻喉科，陕西 咸阳712000

鼻咽癌（NPC）是源于鼻咽黏膜的恶性肿瘤，其发病机制与爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）感染、环境诱导、遗传易感性等有关［1］。患者早期无特异性症状，鼻塞、耳鸣、涕中带血、头痛等症状易被忽视或误诊，约70%的患者错过最佳治疗时期，确诊时已处于中晚期［2］。鼻咽癌具有侵袭性高、转移快、预后差、并发症复杂等特点，目前鼻咽癌的传统治疗包括手术治疗、放疗及化疗，但由于解剖部位深、解剖结构复杂限制了手术疗效，此外，放、化疗常引起免疫降低、继发性肿瘤等的发生［3,4］。因此，寻找延长患者无病生存期，提高预后生命质量，有效减少并发症等的治疗方法具有重要意义。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA分子，缺乏蛋白质编码能力，可以调控很多基因的表达，LncRNAs在鼻咽癌的发生发展起重要作用［5-7］。FOXCUT 其位于促肿瘤生长叉头框基因FOXC1基因启动子的上游，可与STAT3相互作用增强鼻咽癌侵袭能力［8］。有研究显示LncRNA FOXCUT通过靶向FOXC1促进鼻咽癌细胞增殖和迁移［9］，但关于FOXCUT对鼻咽癌细胞作用及调控机制还未见报道。因此，本研究通过干扰长链编码RNA FOXCUT表达，研究其对鼻咽癌细胞上皮间质转化及线粒体功能的影响，以期为LncRNA FOXCUT在鼻咽癌的靶向治疗中提供实验参考。

1 材料和方法

1.1 细胞

鼻咽上皮细胞NP69 细胞株及人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞株（中国典型培养物保藏中心）。50例鼻咽癌及癌旁组织来源于本院（2019年10月～2020年10月），所有入选患者术前均未接受过放疗、化疗或生物治疗等干预措施，所有涉及研究的标本取材均征得患者及家属同意，并经过本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基和Opti培养基（Cellgro）；10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗（武汉普诺赛生物科技有限公司）；Trizol试剂、RIPA裂解液（上海联迈生物工程有限公司）；shRNA FOXCUT载体、shRNA-NC由上海生工生物工程股份有限公司设计合成；磷酸盐缓冲液（PBS）和聚丙烯酰胺凝胶（北京六一生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒和BCA试剂盒（武汉艾迪抗生物科技有限公司）；E-cad、N-cad和Vimentin相关抗体（北京百奥莱博科技有限公司）；SOD、MDA 和LDH 试剂盒（上海江莱生物科技公司）；线粒体膜电位检测试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）；Bax、Bcl-2、caspase3和c-Myc相关抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；脂质体LipofectamineTM2000转染试剂（Thermo Scientific）。

1.3 主要仪器

MR-96T 酶标仪（南京贝登医疗股份有限公司）；CellStream 流式细胞仪（Merck）；BT-50L CO2恒温箱（上海本亭仪器有限公司）；X960荧光定量PCR仪（上海力康生物医疗科技有限公司）；XD倒置显微镜（香港舜宇光学科技有限公司）；Allegra X-15R台式冷冻离心机（贝克曼库尔特）；BSC-A2超净工作台（江苏迅迪仪器科技有限公司）。

1.4 细胞培养

将冻存的CNE1 细胞用水浴锅融化后，转移至RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗），置于37 ℃、5%CO2恒温箱中孵育。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养及后续实验。

1.5 细胞转染

取对数生长期CNE1细胞，PBS重悬后调整细胞密度为1×106/mL，接种于24孔板，设置3个复孔，待细胞生长至40%～60%时，分为5组；空白组（Control）、空载组（shRNA-NC）、干扰组1（FOXCUT-shRNA1）、干扰组2（FOXCUT-shRNA2）、干扰组3（FOXCUT-shRNA3）；弃原培养液，采用无血清Opti培养基对细胞进行饥饿培养，2 h后，采用LipofectamineTM2000脂质体转染法进行细胞转染，当感染复数为10时，在孔内添加5 μg/mL的Polybrene，混匀培养12 h后更换细胞培养液，继续培养3 d 后用嘌呤霉素筛选10 d，筛选稳定感染的细胞株。其中空白组不进行转染处理，空载组采用空转质粒转染，各干扰组分别转染不同干扰序列质粒，培养48 h后收集细胞，进行后续实验。

1.6 RT-PCR检测RNA FOXCUT的表达

取1.5转染后的各组细胞，分别加入Trizol试剂提取细胞样品中的总RNA，进行反转录获取cDNA，加入相应引物，使用荧光定量PCR仪扩增处理，用2-△△Ct法计算FOXCUT mRNA 的相对表达水平。引物序列：FOXCUT-shRNA1 的上游引物为5'-GAAUGGAGAA CUAAGACAAUUAUCT-3'，下游引物为5'-AGAUAA UUGUCUUAGUUCUCCAUUCGG-3'；FOXCUT-shRNA2的上游引物为5'-CAGCCUCCCUCCUGUGUGU GCAGAG-3'，下游引物为CUCUGCACACACAGGA GGGAGGCUGCA-3'；FOXCUT-shRNA3 的上游引物为5'-TCCGATCATCTATCCCTTTACGA-3'，下游引物为5'-CCCGGCTTCAAAAGACTCA-3'；GAPDH 的上游引物为5'-TCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游引物为5'-CGCCCAATACGACCAAATCC-3'。

1.7 CCK8检测细胞增殖倍数

由方法1.6结果，选取FOXCUT-shRNA3为后续实验干扰序列，将细胞随机分为3组：Control组、shRNANC 组和FOXCUT-shRNA3 组，Control 组不作转染处理，shRNA-NC 组采用空转质粒转染，FOXCUTshRNA3组转染FOXCUT-shRNA3质粒。各组细胞稀释后调整细胞密度为1×106/mL接种于24孔板中，设置3个复孔，培养至24、48、72 h，加入CCK-8溶液，培养2 h后弃上层培养液，采用酶标仪测定光密度值A450nm。

1.8 克隆形成实验检测细胞克隆形成率

将CNE1细胞接种至6孔板，约500细胞/孔，按方法1.7 进行分组，培养10 d 后弃掉培养基，乙醇固定30 min，0.5%结晶紫染色，去离子水漂洗晾干，显微镜下观察克隆形成数目，计算克隆形成率。细胞克隆形成率（%）=细胞克隆总数/接种细胞数×100%。

1.9 显微镜观察细胞形态

取Control 组、shRNA-NC 组、FOXCUT-shRNA3组细胞，重悬稀释至以5×106/mL，接种于6 孔板中，2.0 mL/孔，48 h后在400倍倒置显微镜下观察各组细胞的形态并拍照，实验重复3次。

1.10 免疫荧光检测Vimentin+含量

将各组待测细胞接种于细胞爬片上，PBS 浸洗3次；多聚甲醛固定15 min后PBS浸洗。0.5%Triton X-100室温通透20 min，PBS浸洗，吸水纸吸干后玻片上滴加正常山羊血清，室温下封闭30 min，吸掉封闭液，加入一抗，孵育过夜，PBS浸洗，避光加入荧光二抗孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.11 Western blot检测细胞EMT相关蛋白表达

取Control 组、shRNA-NC 组、FOXCUT-shRNA3组细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上静置15 min,低温离心5 min（4 ℃，12 000 r/min），收集上清液，用BCA试剂盒进行蛋白质含量测定，加入适量缓冲溶液煮沸。取样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭后，加入E-cad、N-cad、Vimentin相关抗体处理，再加入显色剂进行检测，应用Image 6.0软件进行灰度值分析。

1.12 试剂盒检测氧化应激标记物的水平

取Control 组、shRNA-NC 组、FOXCUT-shRNA3组细胞，PBS重悬，将细胞浓度稀释至1×107/mL，裂解后离心收集上清液。按照试剂盒说明书分别采用WST-1法、微板法、比色法检测SOD、MDA、LDH水平。

1.13 流式检测线粒体膜电位的变化

取Control 组、shRNA-NC 组、FOXCUT-shRNA3组细胞，PBS重悬，将细胞浓度稀释，根据线粒体膜电位检测试剂盒说明进行操作，加入JC-1荧光探针染液培养20 min，将染色液洗去后，用流式细胞仪进行检测。

1.14 Western blot检测线粒体损伤标记物蛋白的表达

具体操作方法同1.11，选用Bax、Bcl-2、caspase3、c-Myc相关抗体进行实验。

1.15 统计学方法

数据采用SPSS21.0进行数据分析，定量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织及不同鼻咽癌细胞系中FOXCUT表达

与癌旁组织相比，鼻咽癌组织中FOXCUT表达水平均升高（t=13.65，P<0.001，图1）；与NP69细胞相比，CNE1、CNE2、SUNE2、HER2和5-8F细胞FOXCUT表达水平均升高（F=55.81，P<0.001，图1）

图1 鼻咽癌组织及不同鼻咽癌细胞系中FOXCUT表达Fig.1 FOXCUT expression in nasopharyngeal carcinoma(NPC)tissues and different NPC cell lines.A:FOXCUT expression in NPC and adjacent tissues.B:FOXCUT expression in Np69,CNE1,CNE2,SUNE2,HER2 and 5-8F cell lines.*P<0.001 vs Normal tissues,NP69 cells

2.2 不同shRNA 序列干扰LncRNA FOXCUT 表达的影响

与Control 组相比，shRNA-NC 组RNA FOXCUT表达水平差异无统计学意义，3个干扰组RNA FOXCUT表达水平均降低（F=117.15，P<0.001，图2），其中FOXCUT-shRNA3组干扰最为显著，因此选择此组为后续实验干扰组。

图2 不同shRNA序列干扰LncRNA FOXCUT表达的影响Fig.2 Effects of different shRNA sequences on expression of LncRNA FOXCUT.*P<0.001 vs control group.

2.3 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞增殖的影响

与Control组相比，shRNA-NC组细胞增殖倍数及克隆形成率差异无统计学意义，FOXCUT-shRNA3干扰组细胞增殖倍数及克隆形成率降低（F=86.26、85.28，均P<0.001，图3）。

图3 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞增殖的影响Fig.3 Effect of FOXCUT interference on proliferation of NPC cells.A:CCK8 assay for detecting cell proliferation.B:Clone formation assay for assessing clone formation(Original magnification:×200).C:Histogram of cell clone formation rate.*P<0.001 vs control group.

2.4 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞形态的影响

Control组细胞形态呈长梭形，细胞间连接少、间隙大，shRNA-NC组细胞形态与Control组相似；FOXCUTshRNA3干扰组细胞形态呈短梭形、扁平型或圆形，细胞间的连接较为紧密，具有铺路石样特征（图4）。

图4 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞形态的影响Fig.4 Effect of FOXCUT interference on morphology of NPC cells(×400).

2.5 干扰LncRNA FOXCUT 对鼻咽癌细胞EMT 相关蛋白表达的影响

与Control 组相比，shRNA-NC 组E-cad、N-cad、Vimentin 的表达水平差异无统计学意义，FOXCUTshRNA3 干扰组N-cad、Vimentin 的表达水平降低，Ecad的表达水平升高（E-cad：F=22.50，P=0.002；N-cad：F=43.66，P<0.001；Vimentin：F=8.42，P=0.018，图5）。

图5 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞EMT相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of FOXCUT interference on expressions of EMT-related proteins in NPC cells.A:Western blotting for detecting expression levels of E-cad,N-cad and vimentin.B:Histogram of expression levels of E-cad,N-cad and vimentin.*P<0.05 vs control group.

2.6 干扰LncRNA FOXCUT 对鼻咽癌细胞Vimentin+含量的影响

与Control 组相比，shRNA-NC 组Vimentin+含量差异无统计学意义，FOXCUT-shRNA3干扰组Vimentin+含量降低（F=124.8，P<0.001，图6）。

图6 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞Vimentin+含量的影响Fig.6 Effect of FOXCUT interference on percentage of vimentin-positive cells in NPC cells.A:Vimentin-positive cells detected by immunofluorescence assay(×200).B:Histogram of percentage of vimentin-positive cells.*P<0.001 vs control group.

2.7 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞氧化应激标记物的影响

与Control 组相比，shRNA-NC 组SOD、MDA、LDH的水平差异无统计学意义，FOXCUT-shRNA3干扰组MDA、LDH的含量明显升高，SOD的活性明显降低（SOD：F=20.58，P=0.002；MDA：F=25.26，P=0.001；LDH：F=10.39，P=0.011；图7）。

图7 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞氧化应激标记物的影响Fig.7 Effect of FOXCUT interference on oxidative stress markers in NPC cells.A:SOD level.B:MDA level.C:LDH.*P<0.05 vs control group.

2.8 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞线粒体膜电位的影响

与Control组相比，shRNA-NC组线粒体膜电位变化及氧化应激标记物水平差异无统计学意义（P>0.05），FOXCUT-shRNA3干扰组红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显，绿色荧光细胞百分比增加（t=3.44，P=0.026，图8）。

图8 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞线粒体膜电位的影响Fig.8 Effect of FOXCUT interference on mitochondrial membrane potential of NPC cells.A:Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential.B:Histogram of mitochondrial membrane potential.*P<0.05 vs control group.

2.9 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞线粒体损伤相关蛋白表达的影响

与Control组相比，shRNA-NC组线粒体膜损伤相关蛋白表达水平差异无统计学意义，FOXCUT-shRNA3干扰组Bax/Bcl-2、Cleaved cas3/cas3表达上升，c-Myc表达降低（Bax/Bcl-2：F=566.95，P<0.001；Cleaved cas3/cas3：F=38.21，P<0.001；c-Myc：F=73.98，P<0.001，图9）。

图9 干扰LncRNA FOXCUT对鼻咽癌细胞线粒体损伤相关蛋白表达的影响Fig.9 Effect of FOXCUT interference on expressions of mitochondrial damage-related proteins in NPC cells.A:Expression levels of Bax,Bcl-2,caspase-3 and c-Myc detected by Western blotting.B-D:Histogram of the protein expressions.*P<0.05 vs control group.

3 讨论

长链非编码RNA在肿瘤的发生、发展、早期诊断、治疗抵抗和预后等方面具有重要作用［10-12］，其中lncRNA FOXCUT不仅是前列腺癌早期诊断的生物标志物［13］；还能通过激活FOXC1/PI3K/AKT途径促进大肠癌的增殖和侵袭［14］；以及促进食管鳞状细胞癌的进展并预测不良预后［15］，表明lncRNA FOXCUT是癌症潜在的诊断标志物、治疗靶点和预后监测分子。近年来LncRNA、EMT与肿瘤的相互作用关系已得到广泛研究［16,17］。LncRNA可通过调控肿瘤细胞的增殖影响肿瘤的发生发展［18］。通过E-cad、N-cad和Vimentin等变化评估EMT的激活状态［19,20］。研究发现沉默lncRNA FOXCUT基因可能通过靶向FOXC1调控下游EMT相关基因的表达，从而在肿瘤细胞增殖及迁移过程中发挥重要作用［21］。RNA干扰FOXCUT可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性［22］。本研究结果显示，干扰FOXCUT-shRNA后细胞增殖率减少；细胞形态呈短梭形、扁平型或圆形，细胞间的连接较为紧密；N-cad、Vimentin的表达水平降低，E-cad的表达水平升高。这提示干扰FOXCUT-shRNA能够抑制肿瘤细胞增殖及上皮间质转化，缓解鼻咽癌的发展。

与正常细胞相比，由于高代谢率和线粒体功能障碍，癌细胞的ROS水平增加，导致癌细胞比正常细胞更快地达到其氧化应激阈值，致使癌细胞凋亡［23,24］。细胞凋亡是一种受基因调控的细胞主动死亡过程，诱导肿瘤细胞凋亡是癌症治疗的新途径［25］。线粒体是凋亡的重要调控中心，当接收到凋亡信号时，抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax相互作用，促进膜电位的耗散，增加膜的通透性，线粒体表面形成孔道，使促凋亡因子和细胞色素C 释放入细胞质，Caspase 级联反应启动，激活caspase3 等相关表达，从而通过线粒体途径促进细胞凋亡［26,27］。c-Myc是最常见的致癌基因之一，可调控包括细胞生长周期、核糖体生物合成和代谢在内的生理过程，其蛋白表达增加与多种原发性癌症相关［28］。研究指出线粒体膜电位丧失能诱导癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用［29］。FOXCUT靶向MMP-2、MMP-9诱导黑色素瘤细胞凋亡［30］。本研究结果显示干扰FOXCUT-shRNA后细胞MDA、LDH的含量明显升高，SOD的活性明显降低；红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显，绿色荧光细胞百分比增加，线粒体膜电位下降；Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3 表达显著上升，c-Myc 表达显著降低。这提示，干扰FOXCUT-shRNA能够增强鼻咽癌细胞氧化应激反应，降低膜电位，诱导线粒体功能损伤，促进凋亡。

综上所述，干扰长链非编码RNA FOXCUT能够抑制鼻咽癌细胞增殖，减少上皮间质转化，增强氧化应激，降低膜电位，诱导CNE1细胞线粒体功能损伤，促进凋亡；干扰长链非编码RNA FOXCUT对CNE1细胞抑制效果显著，具有靶向治疗鼻咽癌的潜力。