西藏野生鸡腿菇菌塘土壤微生物群落多样性*

尹 秀，陈 蕊，常 萌，孙自立，乔旭辉，禄亚洲**

（1.西藏农牧学院食品科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏农牧学院西南大学药用植物联合研发中心，西藏 林芝 860000）

鸡腿菇（Copriuns comatus） 隶属担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目 （A－garicales） 鬼伞科 （Psathyrellaceae） 鬼伞属 （Coprinus），学名毛头鬼伞，其形似鸡腿，味近鸡丝，因而又名鸡腿蘑[1-2]。鸡腿菇菌柄与菌盖均呈圆柱状，菌盖包被状，子实体较大[3]，肉质细嫩爽滑，鲜美可口，营养丰富[4]。其性平味甘，具有健脾助消，降糖消渴，清心安神之功效，亦可用于辅助治疗痔疮和糖尿病等，其多糖具有抗癌、防癌的特性[5-10]。

有植物第二基因组之称的根际微生物群落，对植物生长有着至关重要的作用[11]，其组成及代谢影响着植物根际养分循环，可分为有益菌、中性菌和致病菌[12]。目前高通量测序技术日趋成熟，已在植物内生菌群落结构[13-18]和土壤微生物群落结构[19-22]等方面得到广泛应用，然而在食用菌相关研究中利用极少，也未见利用高通量测序技术研究鸡腿菇菌塘土壤微生物群落结构的相关报道。

以西藏林芝市野生鸡腿菇菌塘土壤为试验材料，分析野生鸡腿菇菌塘土壤微生物群落结构及多样性，以期为西藏自治区野生鸡腿菇驯化及土壤有益菌种的分离利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用西藏林芝市 （29°39′15.87″N，94°22′04.84″E，海拔：3 000 m）野生鸡腿菇菌塘土壤为试验材料。手带无菌手套，选择10株野生鸡腿菇，采集其菌塘深度为0～20 cm土壤样品（采集时间为2020年7月），将10个土壤样品混合，过无菌的3 mm孔径的筛网，置于无菌采样袋中用低温采样箱带回实验室，-20℃保存备用。设3个重复，分别记为菌塘土壤样本 （S1、S2、S3）。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA及PCR扩增

依据参考文献[23-24]，使用土壤DNA提取试剂盒（北京智杰方远科技有限公司）提取鸡腿菇菌塘土壤样品总DNA，用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测提取基因组DNA的浓度和质量。扩增细菌16S rDNA的V3区～V4区，引物为341F（5’-CCTAYG GGRBGCASCAG-3’） 与 806R （5’-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。扩增真菌 ITS区域，引物为 ITS3F （5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和 ITS4R （5’-TCCTCCGCYYATTGATATGC-3’）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后纯化，随后送至上海美吉生物科技有限公司测序。

1.2.2 数据分析及处理

使用FLASH和fastp软件过滤去除干扰数据，优化测序数据并将高质量数据拼接成Tags序列，利用Usearch软件对上述序列进行聚类分析[25]。按照97%的一致性聚类成为操作分类单元（operational taxonomic units，OUT），将OTU与NCBI数据库比对并对OTU进行物种注释[26-27]。利用QIIME软件进行 Alpha多样性分析 Simpson、Shannon、ACE和Chao指数等[28]。R 3.0软件绘制稀释曲线和进行其他数据分析[29-30]。

2 结果与分析

2.1 野生鸡腿菇菌塘土壤微生物多样性分析

细菌和真菌稀释曲线见图1、图2。

如图1和图2所示，Sobs指数构建的稀释曲线逐渐趋于平缓，表明抽样足够充分，可以进行相关数据分析。

图1 细菌的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve of bacteria

图2 真菌的稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve of fungi

经质控过滤和去除嵌合体，3个样本共获得78 869条细菌高质量序列（effective tags），在97%的相似度水平进行聚类，见图3。

图3 细菌的维恩图Fig.3 Veen diagram of bacteria

如图3所示，从鸡腿菇的菌塘土壤中总共获得了1 899个细菌OUTs，3个样品分别获得了1 723个、1 696个和1 736个OUTs。3个鸡腿菇的菌塘土壤样本共有1 444个细菌OUTs，S1样品特有27个OUTs，S2样品特有23个OUTs，S3样品特有37个OUTs。

3个样本共获得177 689条真菌高质量序列，其在97%的相似度水平进行聚类，维恩图见图4。

如图4所示，鸡腿菇的菌塘土壤中总共获得871个真菌OUTs，3个样品分别获得689个、698个和648个OUTs。3个鸡腿菇的菌塘土壤样本共有492个真菌OUTs，S1样品特有66个OUTs，S2样品特有82个OUTs，S3样品特有51个OUTs。

图4 真菌的维恩图Fig.4 Veen diagram of fungi

Alpha多样性分析结果见表1。

表1 鸡腿菇菌塘土壤微生物群落Alpha多样性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of microbial community from rhizosphere soil of Coprinus comatus

如表1所示，各样品细菌本文库的覆盖度均≥99.03%，各样品真菌本文库的覆盖度均≥99.82%，能够代表相应样本中细菌或真菌的真实信息。

2.2 野生鸡腿菇菌塘土壤微生物群落结构组成

鸡腿菇菌塘土壤细菌共鉴定出9个门，分析结果见图5、图6。

图5 根际土壤细菌门水平群落组成Fig.5 The bacteria community composition of rhizosphere soil at phylum level

图6 细菌群落结构的热图分析（属水平）Fig.6 Heatmap analysis of bacterial community structure at genus level

如图5所示，放线菌门为优势门，按所占比例依次分别为：放线菌门（Actinobacteriota） 31.52%、变形菌门 （Proteobacteria） 29.05%、绿弯菌门（Chloroflexi）11.58%、酸杆菌门（Acidobacteriota）10.90%、拟杆菌门（Bacteroidota） 6.64%、黏菌门（Myxococcota） 2.39%、芽单胞菌门（Gemmatimonadota） 2.25%、髌骨细菌门（Patescibacteria） 2.13%和厚壁菌门（Firmicutes） 0.61%。

如图6所示，在属水平，鸡腿菇菌塘土壤细菌群落中67-14_norank（分类学谱系中无该类层级的科学名称，标记为norank）为优势菌属，RB41为相对优势属，占比超过1.00%属有16属，分别为：67-14_norank（3.48%）、KD4-96_norank（3.26%）、Vicinamibacterales_norank（2.39%）、RB41（2.18%）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium，1.98%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，1.93%）、类诺卡氏菌属（Nocardioides，1.82%）、Ellin6055（1.78%）、Roseiflexaceae_norank（1.77%）、 IMCC26256_norank（1.67%）、Gaiellales_norank（1.61%）、Gemmatimonadaceae_norank（1.57%）、分枝杆菌属（Mycobacterium，1.51%）、Vicinamibacteraceae_norank（1.48%）、Xanthobacteraceae_norank（1.45%） 和黄杆菌属（Flavobacterium，1.42%）。

鸡腿菇菌塘土壤真菌共鉴定出4个门，分析结果见图7、图8。

图7 根际土壤真菌门水平群落组成Fig.7 The fungal community composition of rhizosphere soil at phylum level

图8 真菌群落结构的热图分析（属水平）Fig.8 Heatmap analysis of fungal community structure at genus level

如图7所示，子囊菌门为该样品中的优势门，按所占比例依次分别为：子囊菌门（Ascomycota）73.94%、担子菌门（Basidiomycota） 18.11%、Fungi_unclassified（3.34%）和被孢霉门（Mortierellomycota）3.17%。

如图8所示，鸡腿菇菌塘土壤真菌群落在属水平以谷菌根菌属（Archaeorhizomyces） 为优势菌属，占比超过1.00%属有13属（分类学谱系中未分类的科学名称，标记为unclassified），分别为：谷菌根属（Archaeorhizomyces，16.50%）、Ascomycota_unclassified（14.51%）、Pezizales_unclassified（8.24%）、Knufia（5.40%）、 Hygrophoraceae_ unclassified（5.05%）、鬼伞属（Coprinus，4.41%）、枝孢需属（Cladophialophora，4.02%）、Lasiosphaeriaceae_unclassified（3.53%）、Fungi_unclassified（3.34%）、A－garicales_unclassified（3.17%）、被孢霉属（Mortierella，3.16%）、外瓶柄霉属 （Exophiala，3.06%）。

由图6、图8可直观看出，3个样品微生物物种群落组成在属水平上的异同及丰富度，无论是土壤细菌还是部分土壤真菌在3个样品中的分布均存在一定差异。鸡腿菇菌塘土壤细菌以67-14_norank为优势菌属，与上述群落组成结果一致。鸡腿菇菌塘土壤真菌以谷菌根菌属（Archaeorhizomyces）为优势属，与上述群落组成结果一致。

3 结论与讨论

鸡腿菇营养丰富、保健功能突出，备受人们青睐，市场前景广阔，因此进行野生鸡腿菇驯化和稳产创收的相关研究很有必要。通过采用高通量测序技术解析西藏林芝市野生鸡腿菇菌塘土壤微生物群落组成，优势菌属及有益菌属，可为西藏自治区野生鸡腿菇的驯化和栽培提供参考。

细菌群落结构分析中，菌塘土壤中RB41为相对优势属，丰富度较高的菌属有慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、类诺卡氏菌属 （Nocardioides）、Ellin6055、分枝杆菌属（Mycobacterium） 和黄杆菌属（Flavobacterium）。研究表明，慢生根瘤菌属能够降低植物体内的乙烯含量，从而促进植物生长[31]。鞘氨醇单胞菌属是一类可清除土壤有毒物质且广布于土壤的细菌类群[32-33]，部分菌株能合成分泌有机物，便于植物吸收利用[34-35]。黄杆菌属部分菌种具有降解无机磷的能力[36]。

真菌群落结构分析表明，菌塘土壤真菌群落中谷菌根菌属（Archaeorhizomyces） 为优势菌属，丰富度较高的真菌类群有Knufia、鬼伞属（Coprinus）、枝孢需属（Cladophialophora）、被孢霉属（Mortierella）、外瓶柄霉属 （Exophiala）。枝孢需属（Cladophialophora） 中 Cladophialophora chaetospira SK51菌株不仅具有促进植物生长的活性还具有良好的抑病活性[37]。被孢霉属作为一类解磷真菌，能释放磷于土壤，且参与土壤碳磷循环[38-39]。