基于乙酰胆碱酯酶传感器检测玉米中黄曲霉毒素B1

赵现锋， 孙荣欣*， 丁 琳， 孙向阳

（1.河南轻工职业学院轻化工程系，河南郑州450011；2.河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州450046）

黄曲霉毒素B1（AFB1）是黄曲霉毒素中毒性最强的一种，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍（赵颖等，2018），其广泛存在于土壤、坚果、谷物中，且在食物烹调过程中很难裂解，对人们的饮食、健康危害极大，被世界卫生组织列为最强的致癌物之一。我国食品卫生标准中明确规定玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素B1允许量不得超过20μg/kg（刘冰等，2020；程慧等，2018；沈骏等，2015）。

目前，关于AFB1的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法等（惠媛媛等，2019；朱超等，2018；王瑞鑫等，2016）。这些方法具有检出限低、灵敏度高等优点，但其设备体积大、操作复杂且费时，因此不适合现场的快速检测。电化学法具有设备体积小、操作简单等优点，克服了传统方法的短板，因此在AFB1的快速检测方面潜力巨大。

碳球纳米复合材料具有比表面积较大、导电性好等优点，在电化学传感器方面应用广泛，但其分散性不是很理想，这就限制了其优良的特性（吴民富等，2020；Yanping等，2019；喻理等，2019；Lingwen Zeng等，2019）。目前关于AFB1定量分析的电化学方法已有报道，但鲜见关于氮掺杂碳球负载纳米铂基质酶传感器的报道。本文在碳球的基础上引入氮元素，改善其分散性，同时为了提高其灵敏度，引入纳米铂粒子，制备氮掺杂碳球负载纳米铂纳米复合材料（N-Cs@Pt），并以此为基质制备电化学酶传感器，对AFB1进行定量分析，旨在为玉米中AFB1的快速检测提供一种新的方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料 氯化乙酰胆碱、C3389型乙酰胆碱酯酶、黄曲霉毒素B1：Sigma公司生产；铁氰化钾、亚铁氰化钾：洛阳市化学试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：上海实意化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器 CHI-660E电化学工作站：上海辰华仪器有限公司；JSM-IT800SHL场发射扫描电镜：日本电子JEOL；FJD-120超声波清洗仪：富嘉达超声波设备有限公司；移液枪：德国艾本德股份公司

1.3 实验方法 N-Cs@Pt制备：N-Cs参考Jinhui Tong等（2018）方法制备。取20 mL浓度为0.1 mol/L的柠檬酸钠溶液，加热沸腾10 min。在剧烈搅拌条件下加入5 mL浓度为50 mmol/L的H2PtCl6溶液，然后迅速加入10 mL浓度为0.1 mol/L的抗坏血酸溶液，继续加热搅拌30 min，然后于12000 r/min条件下分别用超纯水、乙醇反复的离心-洗涤3次，最后将离心产物于60℃条件下真空干燥，即得N-Cs@Pt纳米复合材料，备用。

N-Cs@Pt/GCE制备：GCE参考Fang-mei Liu等（2017）、Sujit Deshmukh等（2017）、Huakun Xing等（2016）的方法进行处理。用移液枪准确吸取5μL浓度为1 mg/mL的N-Cs@Pt溶液均匀涂布于GCE表面，然后于25℃条件下干燥，得Cs-N@Pt/GCE，备用。用移液枪分别吸取1μL牛血清蛋白（1.5%）、1μL壳聚糖溶液（1%）和1μL AChE（0.35 U/μL）于0.1 mL的离心管中，超声分散2 min，然后用移液枪将混合液均匀涂布在Cs-N@Pt/GCE的表面，于0～4℃环境下干燥，即得N-Cs@Pt/AChE/GCE传感器。

1.4 样品处理 以玉米为检测对象，采取加标法对其进行检测分析。样品参照GB/T 18979-2003处理，向处理好的样品液中加入一定量的AFB1，然后取100μL的滤液置于5 mL的PBS溶液中，使其浓度分别为5、10μg/mL和20μg/mL，备用。

2 结果与分析

2.1 N-Cs@Pt的SEM表征 利用扫描电镜对制备好的N-Cs@Pt进行扫描，结果见图1。N-Cs@Pt为球形结构，其表面零散分布着制备好的Pt纳米粒子，N-Cs@Pt的粒径约为900～1000 nm。

图1 N-Cs@Pt的扫描电镜图

2.2 不同传感器的EIS表征 以10 mmol/L的[Fe（CN）6]3-溶液为电解质溶液对不同的传感器进行交流阻抗（EIS）表征，结果见图2。

图2 不同传感器的EIS曲线

GCE、N-Cs/GCE、N-Cs@Pt/GCE和NCs@Pt/AChE/GCE的阻抗分别为653.39、145.34、76.94Ω和421.38Ω。修饰N-Cs后其阻抗比GCE降低了77.76%，且N-Cs负载Pt纳米粒子后，其阻抗进一步降低了47.06%。这说明NCs@Pt具有良好的导电性，能有效降低传感器的阻抗，提高传感器灵敏度，但在N-Cs@Pt/GCE表面负载AChE后其阻抗增加了447.67%，这是因为AChE是生物大分子，为蛋白成分，因此当其负载到传感器表面后阻抗显著增加，这也证明AChE已经很好的固定到了传感器表面。

2.3 N-Cs@Pt/AChE/GCE检测AFB1的机理以pH 7.2的PBS（0.1 mol/L）为支持电解质，采用制备好的N-Cs@Pt/AChE/GCE对2.0 mmol/L的ATCl进行差分脉冲（DPV）扫描，然后向其中加入AFB1使其浓度为10μg/mL，抑制10 min然后再对其进行DPV扫描，结果见图3。

N-Cs@Pt/AChE/GCE在2.0 mmol/L的ATCl获得的氧化峰电流（Ip）为2.494μA，经10μg/mL的AFB1抑制10 min后，Ip为1.503μA，Ip降低了39.74%，这是因为AFB1能对AChE产生可逆性非共价键抑制，影响AChE对ATCl的催化，进而影响Ip，且其抑制程度与AFB1存在一定剂量关系，据此可对AFB1进行定量分析。

2.4 分散剂种类 以0.5%壳聚糖为交联剂，分别以1μL不同浓度的牛血清蛋白、奈酚和1μL超纯水做空白对照，制备传感器，对2.0 mmol/L的ATCl进行DPV扫描，结果见图4。

图4 分散剂对传感器的影响

采用的分散剂对传感器有显著影响，且不同浓度的分散剂，对传感器灵敏度的影响存在较大差异。奈酚的最佳浓度为2.0%，最佳浓度下对应的Ip为2.025μA；牛血清蛋白的最佳浓度为1.5%，最佳浓度下对应的Ip为2.512μA，与奈酚相比Ip提高了24.05%。这是因为牛血清蛋白有良好的生物相容性，可以有效防止酶分子的团聚，提高与底物的接触，进而提高催化效率，奈酚虽然对减缓酶分子的聚集有一定作用，但其为有机溶剂，对酶的活性可能存在一定影响，因此，选取浓度1.5%的牛血清蛋白为分散剂。

2.5 固载方式的选择 分别采取a：壳聚糖、AChE和牛血清蛋白混合均匀后涂布于电极表面制备传感器；b：先将AChE和牛血清蛋的混合液涂布于GCE表面，然后再滴加壳聚糖溶液制备传感器；c：先滴加壳聚糖溶液，然后再将AChE和牛血清蛋的混合液涂布于GCE表面制备传感器。然后对2.0 mmol/L的ATCl进行DPV扫描，结果见图5。

图5 固载方式对传感器的影响

采取方式a、b、c所获得的Ip分别为2.501、1.711、2.246μA，这是因为，a固载方式，既能保证酶分子很好的固定在电极表面，又能保证酶分子与底物的充分接触催化，所以其获得的Ip值最大，因此，选取a固载方式制备传感器。

2.6 酶固载量的优化 分别采取0.2、0.25、0.3、0.35 U和0.4 U的AChE制备传感器对2.0 mmol/L的ATCl进行DPV扫描，结果见图6。

图6 酶固载量对Ip的影响

随着酶固载量的增加，Ip先增大后减小，这是因为酶是生物大分子，当其适量增加时，对底物的催化作用明显增强，但当其过量使用时，会导致电极表面的阻抗增大，进而导致Ip减小，因此，酶固载量选取0.35 U。

2.7 抑制时间的选择 采用制备好的N-Cs@Pt/AChE/GCE对2.0 mmol/L的ATCl进行DPV扫描，记录氧化峰电流I0，然后向其中加入AFB1使其浓度为10μg/mL，每隔2 min对其进行扫描一次，分别记录氧化峰电流I2、I4……In。然后计算出其抑制率（抑制率=1-In/I0），结果见图7。

图7 抑制时间对抑制率的影响

随着抑制时间的延长，抑制率逐渐增加，且在2～10 min内增加相对较快，10 min后增加趋势逐渐减弱，因此，抑制时间选取10 min。

2.8 标准曲线绘制 在最佳实验条件下，对不同浓度的AFB1进行抑制测定，结果见图8。

图8 AFB1浓度与抑制率间的关系曲线

AFB1浓度与其对传感器的抑制率在1～30μg/mL内呈良好的线性关系，线性方程为Y=0.9618X+30.214，R2=0.9989，检出限为0.23μg/mL（S/N=3）。

2.9 加标回收率实验 在最佳实验条件下，对不同浓度的AFB1进行加标回收率实验，结果见表1。

由表1可知，其加标回收率为97.83%～102.88%，与HPLC所得到的97.56%～99.26%一致，说明该方法准确度较高。

表1 AFB1的加标回收率实验

2.10 稳定性研究 将制备好的N-Cs@Pt/AChE/GCE置于0～4℃环境中保存，每隔7 d对2.0 mmol/L的ATCl进行DPV扫描，研究传感器的稳定性，结果见图9。

图9 保存时间对N-Cs@Pt/AChE/GCE的影响

随着储存时间的延长，N-Cs@Pt/AChE/GCE对底物的催化效果会略为减弱，但6周后其对底物的催化作用仍能达到正常传感器的95.5%，说明该传感器的稳定性良好。

3 结论

本实验制备了N-Cs@Pt纳米复合材料，并在此基础上制备了N-Cs@Pt/AChE/GCE。结果表明，N-Cs@Pt能显著改善N-Cs@Pt/AChE/GCE的导电性，提高其灵敏度。利用N-Cs@Pt/AChE/GCE对AFB1进行定量分析，AFB1浓度与其对传感器的抑制率在1～30μg/mL内呈良好的线性关系，其加标回收率为97.83%～102.88%，与HPLC所得结论一致，准确度较高。N-Cs@Pt/AChE/GCE的稳定性较好，6周后其对底物的催化作用仍能达到正常传感器的95.5%。所制备的传感器简单、便捷且成本低，为AFB1的快速检测分析提供了一种新的方案。