不同乳酸菌和饲料添加剂体外抑菌效果研究

辛 娜， 邓露芳*， 郭 亮*， 黄玉海， 班文杰， 宗文丽， 刘宪辉

（1.北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司，北京101105；2.北京首农畜牧发展有限公司，北京100076）

随着全球范围内对抗生素的禁用，人们更加关注食品安全，追求绿色养殖。探寻绿色、安全、高效的抗生素替代品逐渐成为畜牧业的研究热点。目前研究较多的有益生菌、植物提取物、酸化剂、酶制剂、抗菌肽等（卜孟娟等，2019；韩冰等，2017；卢国民等，2014；Cheng等，2014）。如何筛选并评价这些新型抗生素替代品显得非常重要。本试验旨在通过牛津杯扩散法筛选出具有体外抑菌效果的乳酸菌及饲料添加剂产品，为饲料替抗技术的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和饲料添加剂 乳酸菌菌株H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8为北京绿荷康牧生物科技有限公司实验室筛选并保存。经生理生化反应及16s rRNA结合鉴定为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、屎肠球菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌。苯甲酸、单宁酸、葡萄糖氧化酶、肠杆菌肽、溶菌酶，由北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司提供。

1.1.2 指示菌和培养基 大肠埃希氏菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）购于广东环凯生物科技有限公司。营养琼脂、营养肉汤、MRSbroth、MRSagar购自北京陆桥技术股份有限公司

1.1.3 其他 灭菌锅、洁净工作台、培养箱、烘箱、水浴锅、牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）、镊子、一次性培养皿、无水乙醇、0.9%生理盐水。

1.2 试验方法 对致病菌的抑制试验参照刘冬梅等（2006）牛津杯扩散法。取灭菌营养琼脂，待温度降至50℃左右时倒平板，每个平皿约15 mL。待琼脂凝固后，用灭菌的镊子夹牛津杯置于营养琼脂平板中。每个平板放置4个牛津杯。分别取大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌0.1 mL（108cfu/mL）加入已经灭菌100 mL营养琼脂中（冷却至50℃左右），摇匀后倾倒，注意不要起泡。待琼脂凝固后，用镊子将牛津杯夹出来，将孔进行标记，标记为1、2、3、4。孔1中加入200μL灭菌MRS液体培养基/配制饲料添加剂的溶剂（表1），取活化18 h的乳酸菌制剂/不同浓度的饲料添加剂200μL，加入2、3、4孔中，3个重复。置于4℃冰箱放置1 h后，置于37℃培养24 h。用游标卡尺量抑菌圈的大小。

表1 不同饲料添加剂的配制浓度 mg/L

2 结果与分析

2.1 单株乳酸菌菌液体外抑制作用试验 从表2可以看出，H1、H3、H4、H8对大肠埃希氏菌有抑制作用，抑菌效果依次为H4＞H3＞H8＞H1。H1、H3、H4对鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用，抑菌效果依次为H1＞H3＞H4。所有乳酸菌菌株对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。

表2 单株乳酸菌菌液体外抑制作用mm

2.2 复配乳酸菌菌液体外抑菌作用试验 从表3可以看出，H1：H4：H5：H6=1:1:1:1复配后对大肠埃希氏菌有抑制作用，H2：H4：H6：H8=1:1:1:1复配后对鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用。H1：H2：H3：H4：H5：H6：H7：H8=1:1:1:1:1:1:1:1复配后对鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用。

表3 复配乳酸菌菌液体外抑菌作用 mm

2.3 单个饲料添加剂体外抑菌作用试验 从表4可以看出，在试验浓度范围内，水解单宁酸的抑菌效果最好，对3株菌均有抑制作用（除浓度500 mg/L对金黄色葡萄球菌没有抑制作用外），且随着单宁酸浓度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越好。葡萄糖氧化酶的抑菌效果次之，200、300 mg/L葡萄糖氧化酶对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用。苯甲酸、肠杆菌肽、溶菌酶对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌没有抑制作用。

表4 单个饲料添加剂体外抑菌作用mm

2.4 复合饲料添加剂体外抑菌作用试验 从表5可以看出，葡萄糖氧化酶200 mg/L+水解单宁酸500 mg/L+苯甲酸2000 mg/L及水解单宁酸500 mg/L+苯甲酸2000 mg/L对3种菌均有抑制作用。葡萄糖氧化酶200 mg/L+水解单宁酸500 mg/L对大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用。葡萄糖氧化酶200 mg/L+苯甲酸2000 mg/L对3种菌均没有抑制作用。

表5 复合饲料添加剂体外抑菌作用mm

3 讨论

目前，常用的抗生素替代品有益生菌、植物提取物、酸化剂、酶制剂、抗菌肽等。这些饲料添加剂在调节肠道微生物区系、抗腹泻、增强机体的抵抗力和免疫力、提高动物生产性能及饲料转化率等方面发挥了重要作用，而这些饲料添加剂的抑菌机理和抑菌效果不尽相同。

3.1 乳酸菌体外抑菌作用 乳酸菌及其代谢产物中富含乙酸、乳酸等有机酸，以及细菌素和过氧化氢等各种抑菌成分（Zhang等，2007；Servin，2004），能有效抑制有害菌。韩庆功等（2018）研究得出，植物乳杆菌及其代谢产物对猪源性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长繁殖产生了抑制作用。郭奇苑等（2010）从15日龄健康犊牛的肠道黏膜和食糜中分离得到4株乳酸菌，对大肠杆菌抑制直径可达16～21 mm。白天天等（2020）研究发现，单菌液中，屎肠球菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果较好。组合菌液中，蒙氏肠球菌和鹑鸡肠球菌组合对大肠杆菌的抑菌能力较强。于翠芳等（2019）从发酵食品中分离出7株乳酸菌，其中4株对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用。本试验结果表明，单菌液除H2、H5、H6、H7没有抑菌作用，复合菌液除H3：H4：H6：H7=1:1:1:1没有抑菌效果外，其他单菌液及复合菌液均有不同程度的抑菌效果。

3.2 饲料添加剂体外抑菌作用

3.2.1 饲料添加剂的抑菌机制 不同饲料添加剂抑菌机制不尽相同。苯甲酸作为酸化剂及防腐剂，可有效抑制多种微生物的生长和繁殖。主要是因为苯甲酸有较强的亲脂性，易通过细胞膜进入细胞体内，从而干扰微生物细胞膜的通透性，改变膜功能，引起菌体形态变化而死亡；另一方面，进入细胞内的苯甲酸分子，可以电离酸化细胞内的碱储，并能抑制微生物细胞呼吸酶的活性，使微生物的代谢受障碍（唐茂妍等，2017）。单宁酸的多元酚羟基结构使其具有良好的收敛抗腹泻、抗氧化、抑菌和抗病毒等生理特性（Frasca等，2012）。单宁酸可能通过2条途径发挥抑菌作用：一是单宁酸与细胞膜和细胞质功能蛋白之间的直接相互作用，二是单宁酸对细菌细胞代谢（如代谢酶、脂质和脂肪酸等）存在二次作用，可引起细菌细胞代谢功能改变（刘秀丽，2013；Bossi等，2007）。葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，具有去葡萄糖、脱氧、杀菌和产酸等特性，能催化β-D-葡萄糖脱氢氧化产生葡萄糖内酯和过氧化氢，葡萄糖内酯会转化为葡萄糖酸。葡萄糖酸呈酸性，可降低肠道的pH，抑制有害菌的生长。生成的过氧化氢具有广谱杀菌作用，可直接抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌的生长繁殖（王佰涛等，2019）。肠杆菌肽是由肠杆菌属的细菌产生的一类小分子量的抗菌肽，肠杆菌肽可以通过膜穿孔作用以及抑制RNA转录酶的活性来针对性的杀灭致病性大肠杆菌以及沙门氏菌等革兰氏阴性菌（Sable等，2000）。溶菌酶又称细胞壁溶解酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶类，能使微生物细胞壁中黏多糖成分分解，降低细菌细胞壁的稳定性，细菌细胞壁会因内、外渗透压不平衡而破裂、细胞质外泄，最终死亡。因革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构不同，导致溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌效果显著好于革兰氏阴性菌（刘益丽等，2013）。溶菌酶对革兰氏阴性菌也有较强的作用（李义等，2012；杨向科等，2005）。

3.2.2 影响饲料添加剂抑菌作用的因素

3.2.2.1 抑菌试验条件的影响 高增兵等（2014）试验揭示，在pH为5.0、5.5时，高浓度的苯甲酸抑菌能力更明显。当pH达到6.0以上时，所有苯甲酸浓度间的抑菌能力趋于一致。汤海鸥等（2015）研究不同处理温度下葡萄糖氧化酶混合液的抑菌效果。结果表明，与常温对照组（25℃）相比，65℃未出现显著差异，高于65℃抑菌效果逐步降低，且65℃与75℃之间有显著性差异。苯甲酸钠对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑制程度随其浓度增加逐渐增强，浓度为0.3%时，抑菌作用骤然加强，当浓度为1.0%时，两种菌生长几乎完全受到抑制（胡春红等，2011）。郑正男等（2015）试验表明，单宁酸在酸性条件下比碱性条件下的抑菌效果更好，呈现出由酸到碱菌落密度增大的趋势，pH为3～7时，显示出良好的抑菌效果，pH为8时，只对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有较好的抑菌效果。

3.2.2.2 抑菌试验方法的影响 潘晓倩等（2014）用5种不同检测方法评价抗菌肽体外抑菌效果，定性抑菌结果揭示，3种琼脂扩散的灵敏度不一致，打孔法的灵敏度最高，其次是滤纸片法，最后是牛津杯法。定量抑菌试验揭示，活菌计数法比酶标比浊法的灵敏度更高。刘如运（2013）结果表明，试管二倍梯度稀释法更为直观、可靠，可进行定量抑菌分析。琼脂扩散法抑菌试验中牛津杯法最好，其次是平板打孔法，进行火焰封底效果更好，滤纸片法结果一般。

3.2.2.3 标准指示菌株的影响 张江等（2018）研究肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌效果，结果表明，0.5%肠杆菌肽对不同种属来源的大肠杆菌、沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）不尽相同。熊海涛等（2019）得出，相同浓度的肠杆菌肽对不同来源的大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌程度不同。

3.2.2.4 饲料添加剂来源的影响 ELizondo等（2010）对不同来源的单宁酸（白坚木、栗木或二者的组合）进行体外试验，研究其对健康动物和患病动物肠道中A、B、C、D、E型产气荚膜梭菌生长的影响，结果发现，栗木单宁酸的抑菌活性优于白坚木单宁酸。

3.2.2.5 其他因素 饲料添加剂中部分添加剂有载体混合处理，载体会干扰试验结果。植物精油类产品会进行包被处理，包被物往往也会影响试验结果。此外，平板的厚度不同也会影响添加剂在平板中的扩散。

本试验结果显示，单宁酸和葡萄糖氧化酶均表现出一定的抑菌作用，而苯甲酸、肠杆菌肽、溶菌酶没有表现出抑菌作用。苯甲酸由于微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，在用琼脂扩散法评价其抑菌效果时，会出现有机溶剂的挥发，导致结果的不准确。肠杆菌肽和溶菌酶没表现出抑菌作用可能与测试浓度的选择、抑菌试验条件（如酸度、温度）、方法的选择、测试菌株不同种属等均有一定关系。复合饲料添加剂试验中，添加单宁酸的复合饲料添加剂均表现出较好的抑菌效果，再次印证水解单宁酸的抑菌效果最好。

4 结论

本试验结果表明，乳酸菌、单宁酸、葡萄糖氧化酶均具有较好的体外抑菌效果。