肉制品中丙二醛的超高效液相色谱检测方法的比较研究

栾君，刘方园，金海涛，陈国友，王翠玲，杜英秋*

（1.黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，黑龙江 哈尔滨 150000；2.黑龙江建筑职业技术学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

肉类制品在加工和贮藏过程中发生的脂质氧化易受含量和组分的影响。脂质氧化随着脂质含量和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）与饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）比例的增加而增加[1-3]。脂质氧化是一个复杂的链式反应过程，起始于活性氧的存在，如超氧阴离子自由基的存在。过氧化物非阴离子自由基可以通过酶和分子氧的非酶促化学还原反应而产生[4-5]。这些活性氧与多种生物分子发生反应，生成醛、酮、酸、醇和碳氢化合物，在结构、风味和颜色方面会产生不良变化，从而降低产品的质量，甚至不利于人类的食用[6-9]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）作为脂质氧化的副产物是测定肉类脂质氧化状态的生物标志物之一。MDA是一种低分子量的挥发性短链 1，3-二羰基化合物（C3H4O2，分子量为 72.07），中等弱酸性（pKa=4.46）[10-12]。

目前，肉制品中MDA含量通常使用硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）进行测定，MDA与2-硫代巴比妥酸反应产生的红色色素体MDA-TBA2可通过分光光度计在530 nm～535 nm处检测[13]。尽管TBARS法已被用于测定牛羊肉、猪肉、腊肠和香肠中的脂质氧化，且这种分析方法简单且可重复性高，但测定的MDA的含量往往比真实值偏高[14]。此现象可能是由于TBA与羰基化合物、糖、水溶性蛋白质、多肽和基质中存在的许多其他化合物反应而形成与MDA-TBA2相同波长的物质或在基质中存在吸收此波长的物质，如色素[15-18]。采用液相色谱—荧光检测器或二极管阵列检测器可提高MDA分析的特异性，可使MDA-TBA2从其它TBARS物质或干扰化合物中进行分离和定量[19]。本研究的目的是建立一种基于超高效液相色谱-荧光检测器（ultra-performance liquid chromatography-fluorescence detector，UPLC-FLD）或超高效液相色谱-二极管阵列检测器（ultra-performance liquid chromatography-diode array detector，UPLC-DAD）的准确且快速的检测方法，并与TBARS分光光度法进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2，6-di-tert-Butyl-4-methylphenol，BHT，纯度≥99.9%）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA，纯度≥99.5%）、1，1，3，3-四甲氧基丙烷（1，1，3，3-tetramethoxypropane，TMP，99%）、磷酸溶液（85%）、乙醇（分析级）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；2-硫代巴比妥酸（TBA，纯度≥99%）、乙腈（色谱级，超梯度99.9%，0.2 μm）：美国默克公司。

1.2 仪器与设备

Milli-Q净水系统：德国默克集团；Microfuge16离心机：美国贝尔曼库尔特有限公司；ART MICCRA D-1均质器：德国ART有限公司；Waters ACQUITY HClass超高效液相色谱[配有Acquity UPLC HSS（高强度硅胶）色谱柱]、ACQUITY UPLC光电二极管阵列检测器、Waters 2475多通道荧光检测器：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

猪肉：将猪背最长肌切片置于商品包装中，在改良的环境下陈化至保质期限（4℃，8 d）；鸡肉：将鸡腿肉置于商品包装中，在改良的环境下陈化至保质期限（4℃，8 d）；牛肉/羔羊肉：将牛肉/羔羊肉背肌切片放入聚苯乙烯托盘中，用透氧塑料薄膜包装，在4℃避光的条件下保存，分别于1、4、8、12 d进行优化分析以获得MDA含量较高的样品，最终确定以4 d成熟后的样品为例进行后续的检测分析；这些生肉样品的陈化期结束后，使用切碎机将样品（200 g～250 g）均质化，并以每份10 g进行等分并存储。香肠、火腿和牛肉汉堡等商品样品在购买当天拆下包装，同样用切碎机将200 g～250 g的样品均质化，等分成每份5 g进行贮存，所有生肉和肉制品均在-20℃下进行真空包装和冷冻贮存。

所有肉类基质的提取方法都相同，仅样品称取量不同：生肉10 g，肉制品5 g。每个样品在50 mL离心管中称重。将50 μL的7.2%BHT加入乙醇中，在超纯水中加入将10 mL的10%的TCA，利用均质器对混合物进行45 s均匀化。将样品在4℃条件下4 000×g离心15 min，随后使用滤纸（直径150 mm）过滤。取1 mL注入到10 mL的EP管中，加入1mL 10 mmol/L TBA溶液，进而衍生出MDA。通过沸水浴进行孵育45 min，冷却后将 150 μL 注入至 800 μL 的超纯水 30∶70（体积比）的EP管中，并将提取液过滤到2 mL琥珀色螺旋帽小瓶中。对于分光光度法无需进行稀释，直接在衍生化反应后进行测定。

1.3.2 试剂的制备

三氯乙酸使得样品中的蛋白沉淀并提供一种酸性介质，促使MDA与TBA反应形成MDA-TBA2。在超纯水中制备10%的TCA溶液，在28℃～32℃下超声20 min，直至所有固态TCA溶解，所得溶液可在室温（20℃）且避光条件下稳定保存数月。在10%的TCA溶液中制备10 mmol/L的TMP溶液。将TMP溶液在28℃～32℃下超声处理5 min，并在室温（20℃）下避光保存2 h。在此期间，TMP反应生成MDA，得到10 mmol/L的MDA溶液（TMP的一个分子生成MDA分子）。从10 mmol/L MDA溶液开始，制备8个不同浓度的MDA标准品，从0.25 μmol/L～40 μmol/L的MDA溶液，全部稀释在10%的TCA中。

在超纯水中制备10mmol/L的TBA溶液。在28℃～32℃下将TBA溶液超声处理20 min，直到所有固体TBA溶解。该溶液在室温（20℃）下避光可稳定保存一周左右。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚作为抗氧化剂，可避免在样品处理过程中生成新的MDA。在乙醇中制备7.2%的BHT溶液。在室温（20℃）下，BHT溶液在定轨摇床中振荡15 min。

1.3.3 UPLC的条件与方法

流动相A乙腈和流动相B磷酸溶液（0.3%），流速为0.2 mL/min（25%A和75%B）。将样品与色谱柱的温度分别调节至25℃和35℃。注射体积为5 μL，色谱过程的总运行时间为5 min。通过532 nm处的吸光度和λ激发=530 nm和λ发射=550 nm处的荧光对MDA-TBA2进行检测。通过对保留时间和光谱分析与标准品进行比较来定量测定MDA-TBA2，基于外部校准（线性曲线）对0.02 μmol/L至40 μmol/L之间的不同MDA标准品进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 方法的特异性

通过荧光检测器得到的标准品和牛肉样品色谱图结果如图1所示。

图1（A）是MDA标准品衍生化后的MDA-TBA2色谱图，浓度从 0.25 μmol/L～40 μmol/L；图 1（B）中的色谱图分别对应于MDA-TBA2标准品和牛肉样品。该方法的特异性极高，因此在所监测的波长（λ激发=530 nm和λ发射=550 nm）下研究的基质中几乎无其他相关的干扰峰，极大地简化了色谱数据的处理，提高了相关肉制品分析方法的特异性和选择性。

图1 衍生化后的MDA-TBA2色谱图Fig.1 MDA-TBA2chromatogram after derivatization

2.2 样品前处理的优化

在1.3.1中，样品前处理是依据不同参数可能影响分析过程的优化结果。所评估的参数包括TCA浓度、TBA浓度和生成MDA-TBA2的反应时间。首先，基于过量的TBA（20 mmol/L）对同一牛肉样品中不同浓度的TCA进行测定，并在沸水浴中优化孵育时间。低浓度（0.5%和1%）的TCA不能有效地沉淀基质中的蛋白质，因此，分别针对 3%、5%、8%、10%、12%的TCA浓度和 15、30、45、60 min的反应时间进行 4次重复试验，结果如图2所示。

图2 TCA浓度和反应时间的优化Fig.2 Optimization of TCA concentration and reaction time

从样品中定量提取MDA至少需要10%，并且在沸水浴中反应30 min以上才能定量形成MDA-TBA2。由图2可知，以10%的TCA作为萃取剂，反应45 min是形成MDA-TBA2的最佳孵育时间。以10%的TCA作为萃取剂，45 min为反应时间来优化TBA的浓度，进行4次重复试验，结果如图3所示。

图3 TBA浓度的优化Fig.3 Optimization of TBA concentration

可以明显得出在10 mmol/L处荧光强度最高，即最佳的TBA浓度为10 mmol/L。在90℃～100℃的温度下，2-硫代巴比妥酸在酸性介质中与MDA反应形成红色加合物MDA-TBA2。MDA-TBA2化合物在532 nm处摩尔吸光度较高，并在λ激发=530 nm和λ发射=550 nm时具有高荧光。与直接测定相比，TBA对MDA进行衍生化可提高MDA分析的灵敏度和特异性。

2.3 方法的灵敏度

不同方法的灵敏度比较见表1。

表1 不同方法的灵敏度比较（n=4）Table 1 Sensitivity comparison of different methods（n=4）

由表1可知，3种分析方法在MDA-TBA2化合物与信号之间均表现出良好的线性响应，对于分光光度法和 UPLC-DAD法，在 0.25 mmol/L～40 mmol/L的MDA具有较大的线性范围，而对于UPLC-FLD法在0.04 mmol/L～40 mmol/L之间的MDA存在较大的线性范围。线性方程具有较高的确定系数，R2在0.998 1～0.999 6。检测线与定量限较低，足以确定待测基质中MDA的含量。与分光光度法相比，UPLC-FLD方法的灵敏度有了较大提升，待测样品中的检出限提高了20倍以上。

2.4 不同方法对MDA定量分析的影响

3种方法测定样品中MDA的浓度见表2。

由表2可知，基于所研究的定量方法对所有基质MDA的浓度进行测定。由于分光光度法是最常用的方法，所以本研究结果与分光光度法相关研究[20]的结果基本一致。在鸡肉、猪肉、牛肉和羊肉等生肉样品中，鸡肉的MDA浓度最高，因其具有较高的脂肪含量和最利于脂质氧化的PUFA/SFA比值，并且鸡大腿肉是一种更易于降解类型的肉基质。不同类型的腊肠脂质氧化MDA值变化很大，影响脂质氧化的因素很多，例如成分、加工条件和成熟时间等。在所有待测基质中，腊肠的MDA含量最高，这可能是因为2种产品中脂肪含量较高，风干过程促进了脂质氧化，从而促进了MDA的形成[21]。与生肉样品相比，MDA值较低的肉制品因在加工过程中添加了抗氧化剂和防腐剂，或因热处理而导致MDA的降解。牛肉汉堡中MDA含量与生牛肉的MDA值相似。

表2 3种方法测定样品中MDA的浓度（n=4）Table 2 Determination of MDA concentrations in samples by three methods（n=4） mg/kg

定量方法对所有待测样品中MDA含量的影响均有显著性差异（p＜0.05）。在UPLC-DAD和UPLC-FLD进行比较时，除了S7和S8样品有显著性差异（p＜0.05），这两种方法的MDA值基本一致（p＞0.05）。尽管在这些基质中，用UPLC-DAD方法估算的MDA浓度更接近检测限。但在这些样品中，UPLC-FLD方法更为可取。两种UPLC方法与经典TBARS分光光度法比较，除牛肉样品外（p＞0.05），所有样品中的所有MDA含量均存在显著性差异（p＜0.05）。与UPLC方法相比，分光光度法检测MDA含量明显高于实际值。生肉样品中MDA含量为4%～62%，加工肉制品中MDA含量为54%～2 068%。生肉样品中MDA值高估是由于TBA会与羰基化合物、糖、水溶性蛋白质、多肽和基质中存在的许多其它化合物发生反应。肉制品中MDA值高估是由于TBA与基质中存在的化合物发生反应；以及由于存在可直接干扰或与TBA反应产生新的干扰化合物的香料和色素。

2.5 方法的基本参数

UPLC法的中间精密度、重现性和回收率见表3。

表3 UPLC法的中间精密度、重现性和回收率（n=4）Table 3 Intermediate precision，reproducibility and recovery of UPLC method（n=4）

由表3可知，UPLC-DAD和UPLC-FLD方法的重现性，中间精密度和回收率。UPLC-FLD法对所有样品具、s）为4.2%～8.4%，肉制品比生肉样品变异系数低，可能是由于生肉原料不易均质化。若将生肉冻干再进行均质化，则可以解决此类问题，从而便于对代表性等分试样进行采样。

此外，使用冻干样品将极大地便于样品的处理，由于可以使用轨道振荡器代替高性能的均质机进行MDA的提取，从而使该方法更加方便、快捷并提高了准确性。相比较而言，UPLC-DAD分析方法的重现性比UPLC-FLD法的重复性差。UPLC-FLD法也为所有样品提供了较好的中间精密度，在5.5%至9.2%的范围内，与UPLC-DAD法的趋势一致。在回收率方面，UPLC-FLD法针对所有样品均获得了较好的MDA回收率值，不管是低加标浓度（MDA=0.1 mg/kg）还是高加标浓度（MDA=1.0 mg/kg），回收率在 91.4%～108.5%范围内，而UPLC-DAD方法与UPLC-FLD方法的回收率相比略低（除个别样品外）。

3 结论

本研究基于TCA萃取促使TBA衍生化进而与MDA反应形成MDA-TBA2，通过UPLC-FLD法和UPLC-DAD法对其进行定量分析，通过与传统的TBARS分光光度法进行对比，从而确定最佳的UPLC方法。该方法快速、简单，对所研究的样品（肉和肉制品）均具有良好的分析性能，包括特异性、灵敏度、精密度、重现性和回收率。若没有UPLC-FLD的使用条件，也可以用UPLC-DAD来量化MDA的含量，但需注意的是，在低浓度时其检测限较高。分析评估冻干样品而不是新鲜肉类将具有一定的研究前景，因为冻干可能会简化方法，减少试剂的使用，并能够提高方法的灵敏度和精密度等分析性能的参数。此方法还可用于测定其它原料和加工制品（例如鱼和鱼制品）中MDA的含量，为其相关研究提供一定的理论依据。