MCP-1和CD105在稽留流产患者蜕膜组织中的表达及意义

刘学 栾晓瑾 肖正华

稽留流产（missed abortion，MA）指胚胎或胎儿已死亡，仍然滞留在宫腔内，未能及时从阴道排出[1-2]。MA是妊娠早期的常见并发症，在我国的发生率约为13.4%，且呈逐年递增的趋势[3]。MA发病因素复杂，目前研究认为其发生与染色体异常、生殖道感染、母体系统疾病、内分泌失调和解剖缺陷等有关。然而仍有30%的MA病因尚不明确[4]。近年来，有研究发现单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）作为重要的趋化因子，在胎盘中广泛表达[5]。并且有研究指出当胚泡植入后MCP-1表达受抑，有助于胎盘的发育和妊娠的维持[6]。在复发性流产和反复着床失败的发展过程中，MCP-1能够将单核细胞募集到损伤和感染部位上，发挥促炎效应，从而导致不良结局[7]。胎盘的发育伴随着滋养细胞的侵袭和子宫螺旋动脉的重塑，这一过程受一系列血管生成因子的调控。CD105作为血管生成的相关标志物之一，参与维持血管内皮细胞的稳定，在胎盘组织中也呈广泛表达[8]。然而目前尚未有文献报道MCP-1和CD105在MA中的作用。本研究通过检测MA和正常宫内早孕要求终止妊娠者蜕膜组织中MCP-1和CD105的表达水平，探讨MCP-1和CD105在MA发生、发展中的作用，为进一步研究MA的发病机制提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2020年6至12月重庆医科大学附属永川医院收治住院的10例MA患者作为MA组，选取同期收治住院的10例正常宫内早孕要求终止妊娠者作为对照组。MA组纳入标准：（1）孕周7～13周；（2）年龄20～35周岁；（3）彩超检查提示胚胎停止发育；（4）胚胎无染色体异常。对照组纳入标准：（1）孕周 7～13 周；（2）年龄20～35周岁；（3）彩超检查提示宫内妊娠，可见心管搏动。两组排除标准：（1）伴有全身性或生殖道的感染；（2）既往有不良孕产史；（3）有心血管系统、免疫系统、肝肾功异常的患者；（4）妊娠期间应用保胎药物。两组对象年龄、孕周、孕次、产次比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本研究经重庆医科大学附属永川医院医学伦理委员会审批通过，所有对象均签署知情同意书。

表1 两组对象一般资料比较

1.2 主要仪器和试剂 FACSCanto Ⅱ流式细胞分析仪、电泳仪、制胶板、电泳槽、成像仪、Stain Buffer（批号：554657）均购自美国 BD公司；BCA试剂盒（批号：B00S001100）、Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS，批号：G4200）、4%多聚甲醛溶液（批号：AR0211）均购自中国鼎国公司；FBS（批号：F8687）和胶原酶Ⅳ（批号：V900893）均购自美国Sigma公司；ficoll分离液（批号：17544652）购自美国 Cytiva公司；CD45-APC-Cy7（批号：B314603）、MCP-1-PE（批号：B193217）、CD105 抗体（批号：10010278）、山羊抗小鼠单克隆抗体（批号：SA00001-1）、DAB 显色试剂盒（批号：PK10005）均购自美国Proteintech公司。

1.3 标本采集 术后立即收集两组的蜕膜组织，使用预冷的0.9%氯化钠溶液洗净组织的血液，直至漂洗液呈无色，一部分蜕膜组织放入冻存管内，置于-80℃冰箱保存，用于行流式细胞术和Western blot检测；一部分组织石蜡包埋后常温保存，用于免疫组化染色。

1.4 蜕膜免疫细胞（decidual immunocyte，DIC）中MCP-1表达水平检测 采用流式细胞术。两组每例各取50 g蜕膜组织于EP管中剪碎，加入1 ml浓度为0.01 g/ml的胶原酶Ⅳ消化30 min。然后加入5 ml含有10%FBS和1%双抗的完全培养基终止消化，用70 μm细胞过滤器过滤，收集沉淀细胞，然后使用5 ml DPBS重悬备用。另外准备一只15 ml离心管，将密度为1.077的5 ml ficoll分离液缓慢加入其中，再将准备好的细胞悬液缓慢覆盖在ficoll分离液上。使用水平离心机以2 500 r/min离心15 min，在5 ml的位置可见一层云雾状的液面则是所需DIC，缓慢将其吸出，离心后用Stain Buffer重悬，调整细胞浓度为1×106/ml。吸取100 μl上述细胞悬液放置于流式管中，分别加入CD45-APC-Cy7、MCP-1-PE流式荧光抗体各2.5 μl，然后避光孵育30 min，再用DPBS洗涤两遍后，用DPBS重悬至500 μl，立即用流式细胞仪检测。应用Flowjo软件测定MCP-1阳性细胞的比例，并进行统计学分析。

1.5 蜕膜组织中CD105的定位及表达水平检测 采用免疫组化法。分别取两组蜕膜组织石蜡块切片固定后做好标志，然后进行脱蜡和水化处理，再滴加 50 μl 10%BSA溶液于切片上，室温孵育60 min进行封闭，然后将50 μl抗-CD105鼠抗稀释液滴加在切片上 4℃孵育过夜。再用PBS洗涤后，向每个切片中添加100 μl二抗稀释液（1∶500），并在 4 ℃下再次孵育 50 min，阴性对照组使用PBS代替一抗。最后使用DAB显色，将所有切片用苏木精复染，通过分级乙醇脱水并用中性树胶封固。将制备好的切片置于显微镜下观察，并且随机选择3个视野（×10）进行拍摄。使用Image J软件测量每个视野CD105阳性信号的平均光密度值（average optical density，AOD），并进行统计学分析。

1.6 蜕膜组织中CD105表达水平检测 采用Western blot法。分别取两组每例蜕膜组织30 mg，严格按照BCA试剂盒测定蛋白浓度，然后置于-80℃冰箱内保存。分别配制10%分离胶和4%上样胶，待胶凝固后，每孔加入30 μg蛋白，然后在100 V恒压条件下进行跑胶，跑胶结束后，按照黑胶白膜的顺序于转膜液中组装夹板，将组装好的夹板放入转膜槽中，以恒定电流250 mA转90 min，转膜结束后将膜放置在5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后加入1∶1 000稀释的鼠抗CD105单克隆抗体，4℃孵育过夜，再用TBST洗膜3次，接着用对应一抗种属的二抗稀释液（1∶1 000）敷育1 h后用TBST洗膜，最后用ECL发光检测试剂盒进行化学发光检测。使用Gel-Proanlyzer软件进行灰度定量分析。

2 结果

2.1 两组DIC中MCP-1表达水平比较 与对照组比较，MA组患者DIC中MCP-1阳性细胞比例明显升高，差异有统计学意义[（36.27±3.98）%比（15.17±7.62）%，P＜0.05]，见图 1。

图1 两组蜕膜免疫细胞（DIC）中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达水平比较（a：两组DIC中MCP-1表达的流式细胞图；b：两组DIC中MCP-1阳性细胞比例比较的柱状图，*P＜0.05；MA为稽留流产）

2.2 两组蜕膜组织中CD105表达水平比较 免疫组化结果显示，CD105在两组蜕膜基质细胞的细胞质与细胞核中均有表达，见图2a-b；与对照组比较，MA组患者蜕膜组织中CD105表达水平升高，差异有统计学意义（5.40±0.49 比 3.03±0.21，P＜0.05），见图 2c。Western blot结果显示，与对照组比较，MA组蜕膜组织中CD105蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（3.38±0.29比2.29±0.42，P＜0.05），见图 3。

图2 两组蜕膜组织中CD105的定位和表达水平[a：稽留流产（MA）组蜕膜组织免疫组化染色所见，×10；b：对照组蜕膜组织免疫组化染色所见，×10；c：两组蜕膜组织中CD105平均光密度值（AOD）比较的柱状图，*P＜0.05]

图3 两组蜕膜组织中CD105蛋白表达水平比较（a：两组蜕膜组织中CD105蛋白表达的电泳图；b：两组蜕膜组织中CD105灰度值比较的柱状图，*P＜0.05；MA为稽留流产）

2.3 两组MCP-1阳性细胞比例与CD105蛋白表达水平的相关性分析 两组MCP-1阳性细胞比例和CD105蛋白表达水平均呈正相关（r=0.931和0.940，均P＜0.01），见图4。

图4 两组单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）阳性细胞比例与CD105蛋白表达水平的散点图[a：稽留流产（MA）组；b：对照组]

3 讨论

在胚胎植入过程中，子宫内膜受卵巢激素的调控，促进子宫内膜间质细胞转变为较大圆形的蜕膜细胞，称为蜕膜化。同时，具有侵袭性的绒毛外滋养层细胞（extra villous trophoblasts，EVTs），植入和浸润至蜕膜化的子宫内膜中，促进螺旋动脉的形成和重塑，为生长中的胎盘和胎儿提供营养和氧气[9]。蜕膜化是成功建立和维持妊娠必不可少的一环，蜕膜基质细胞现已被认为是胎盘的主要免疫调节细胞之一，具有调节滋养细胞侵袭，抵抗炎症和氧化应激以及抑制母体局部免疫反应的独特能力[10-11]。一旦蜕膜化障碍则会导致EVTs迁移和侵袭受损，使螺旋小动脉重塑不足，胎盘血流量减少，进而导致胎盘缺氧。同时，蜕膜基质细胞释放各种胎盘因子，激活系统炎症反应，最终导致一系列妊娠并发症，如胎儿生长受限、先兆子痫和流产等[12-13]。本研究中所涉及的MCP-1和CD105是公认的与炎症免疫和血管形成相关的关键分子，本研究通过检测MA患者蜕膜组织中MCP-1和CD105的表达水平，从而为探究炎症和血管形成在MA发生、发展中的作用提供理论依据。

母胎界面主要由来自母体的蜕膜和来自胚胎和胎盘的滋养细胞组成，作为半同种异源的胚胎，不被母体免疫系统排斥，依赖于DIC的免疫调控。母胎界面的DIC主要由NK细胞、巨噬细胞、T细胞和多种少数细胞类型（如树突状细胞、自然杀伤T细胞等）组成[14]。蜕膜NK（dNK）细胞是最大的细胞群，在妊娠早期占母体免疫细胞的50%～70%，dNK细胞具有维持蜕膜微环境稳态的多种功能[15]。目前已被证实，dNK细胞数量和功能的变化与妊娠并发症有关，如流产、胎儿宫内生长受限和子痫前期等[16]。而MCP-1是子宫内NK细胞的有效引诱剂和激活剂，MCP-1的升高能激活和招募dNK细胞，使dNK细胞从它的自然保护作用转变为类似于具有细胞毒性的NK细胞，释放穿孔素和诱导滋养层细胞凋亡，导致流产[17]。此外，在胚泡植入的过程中，大量MCP-1由蜕膜巨噬细胞诱导释放，从而进一步将单核细胞激活为巨噬细胞并招募至母胎界面，参与炎症的发生[18]。蜕膜组织中MCP-1表达的升高可能促进促炎型巨噬细胞募集，进而分泌大量炎性细胞因子（如TNF-α、INF-γ和IL-1等），进一步增强MCP-1的表达，形成一个正反馈回路，最终导致不良妊娠结局[19-20]。本研究发现，MA组蜕膜组织中MCP-1的表达水平明显高于对照组，提示MCP-1在MA中发挥重要作用。因此笔者推测蜕膜组织中MCP-1水平参与了母胎界面的免疫失衡，MCP-1水平升高，直接导致了dNK细胞活性的改变，使其发挥细胞毒性作用。同时，MCP-1还可能通过诱导蜕膜巨噬细胞数量和功能的改变，发挥促炎的作用，最终导致MA的发生。

EVTs入侵子宫蜕膜后，与dNK和蜕膜巨噬细胞之间相互影响。在EVTs的植入过程中，螺旋小动脉壁的平滑肌细胞和内皮细胞不断降解，螺旋动脉从窄口径、高阻力血管转变为大口径、低阻力血管，血液以较低的流速向绒毛间隙输送，促进胎盘和胎儿的生长发育[21]。螺旋动脉发育障碍严重影响了胎盘和胎儿的发育，最终导致各种妊娠并发症。有研究指出，在子痫前期患者的血清中观察到CD105的表达水平显著上调，高水平的CD105导致血管内皮功能障碍、血管收缩和免疫失调，从而对母体和胎儿产生不良影响[22]。CD105是转化生长因子-β的跨膜辅助受体，能够干扰TGF-β与其受体的结合，抑制内皮一氧化氮合酶对血管的扩张作用，导致血管生成障碍，最终影响胎盘发育[23]。目前已经发现CD105除了抗血管生成的作用外，也可以参与炎症过程并调节免疫反应。CD105可以促进单核巨噬细胞的黏附和迁移，诱导促炎型的巨噬细胞分化，从而导致不良的妊娠结局[24]。本研究中，与对照组相比，MA组CD105的表达水平呈上调趋势，差异有统计学意义。因此笔者推测，CD105可能通过抑制血管发育和诱导炎症免疫反应来促进MA的发生。蜕膜组织中CD105表达水平上调，一方面证实了在MA患者中，存在胎盘血管发育障碍。另一方面，CD105作为炎症的调控因子之一，同MCP-1一样，也能导致促炎型巨噬细胞增多，加剧母胎界面的炎症反应爆发，最终导致MA患者的胚胎死亡。同时相关性分析显示，在蜕膜组织中，MCP-1和CD105呈正相关，这提示MCP-1和CD105两者可能存在着相互作用，从而共同调控MA的发生，但这仍需要进一步研究。

综上所述，本研究显示MA患者蜕膜组织中MCP-1和CD105高表达。MCP-1表达水平的升高，促使DIC的数量和活性发生改变，从而导致母体界面的免疫失衡。同时CD105的上调，导致子宫螺旋小动脉形成和重塑障碍，使胎盘发育不良，最终导致MA的发生。探讨MCP-1、CD105与MA的关系，有利于为研究MA的发病机制提供新的理论依据。