酸枣仁皂苷A促进大鼠股骨骨折愈合的机制研究

张兵 朱亚辉 王孝玉 周思私 袁发 胡凌云

据统计，骨折后延迟愈合或不愈合的比例约为10%[1-2]。其中骨折断端处的炎症反应被认为是骨折延迟愈合的重要原因之一[3]。酸枣仁皂苷A是从酸枣仁中分离得到的三萜皂苷，具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡和神经保护等多种生物活性[4-5]。本研究团队通过前期实验发现，酸枣仁皂苷A可以通过激活生长转化因子/骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞分化，形成骨组织，用于治疗骨折延迟愈合或不愈合非常有潜力（尚待发表）。本研究通过构建大鼠股骨骨折模型，探讨酸枣仁皂苷A是否通过NF-κB信号通路对骨折愈合产生促进作用，以期为临床应用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠40只，体重（220±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（川）2020-030，使用许可证号：SYXK（川）2019-189。本实验经南充市中心医院医学伦理委员会伦理审批通过[2021年审（032）号]。

1.2 主要药物、试剂和仪器 酸枣仁皂苷A（批号：A0274），纯度≥98%，购自成都曼思特生物科技有限公司；BMP-2（批号：ab214821）、NF-κB 抑制剂蛋白-α（nuclear factor kappa B inhibitor protein，IκB-α）（批号：ab32518）、NF-κB 抑制蛋白激酶-β（nuclear factor kappa B inhibitor protein kinase，IκK-β）（批 号 ：ab178870）、NF-κB（批号：ab76302）和 β-肌动蛋白（β-actin）（批号：ab6276）抗体均购自艾博抗（上海）贸易有限公司；IL-1β（批号：ml003057）、IL-6（批号：ml102828）、TNF-α（批 号 ：ml002859）、ALP（批号：ml003360）、骨钙素（bone gla protein，BGP）（批号：ml002883）ELISA 检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。VTE1600动物数字化X线影像系统购自南京普爱医疗设备股份有限公司；转轮式切片机购自德国徕卡公司；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪均购自常州市中威电子仪器有限公司；RS36型全自动染色机购自常州派斯杰医疗设备有限公司；BA210 Digital数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团有限公司；多功能凝胶成像仪、蛋白质电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与大鼠骨折模型的构建 将40只SD大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、酸枣仁皂苷A低剂量组和酸枣仁皂苷A高剂量组4组，每组10只。大鼠经适应性喂养1周后，腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为30 mg/kg，3 g溶于100 ml 0.9%氯化钠注射液中，1 ml/kg）进行麻醉。除空白组外，其余3组大鼠麻醉后构建左侧股骨闭合骨折模型。待翻正反应消失后对大鼠进行局部脱毛，使用碘伏在大鼠左股骨髁间窝处消毒，将直径1.0 mm克氏针从骨髁间窝处垂直刺入直达髓腔，拔出克氏针后于股骨中段处徒手折断股骨，注意避免骨折移位，然后将克氏针从原穿针点插到断骨远端，剪断克氏针外露部分，局部消毒后归笼，苏醒后正常饮食饮水。

1.3.2 给药 造模后第2天开始，各组分别给药，空白组与模型组大鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液（20 ml/kg），酸枣仁皂苷A低剂量组腹腔注射10 mg/kg酸枣仁皂苷A（50 mg溶于 100 ml 0.9%氯化钠注射液，20 ml/kg），酸枣仁皂苷A高剂量组腹腔注射20 mg/kg酸枣仁皂苷A（100 mg溶于100 ml 0.9%氯化钠注射液，20 ml/kg）；1次/d，共28 d。给药开始后28 d进行后续指标检测。

1.3.3 大鼠骨折愈合情况观察 各组大鼠于给药开始后14、28 d使用动物数字化X线影像系统进行拍照，观察各组大鼠骨折愈合情况。

1.3.4 大鼠骨折股骨骨痂病理学评分 给药开始后28 d分离4组大鼠左侧股骨，剔除分离软组织，暴露骨痂，拔除髓内克氏针，取股骨中段处愈合骨痂进行石蜡封片（空白组于相同骨折位置取材），HE染色后在显微镜下拍照观察，并进行评分：评分根据损伤处结缔组织、软骨、骨增生修复的程度，分为5级，以软骨及骨组织占所有增生组织（包括结缔组织、软骨、骨组织）的比例记分，软骨及骨组织占1/5者记为1分，软骨及骨组织占2/5者记为2分，依此类推，损伤处完全由软骨及骨组织取代者（即软骨及骨组织占5/5）记为5分，分值越高，提示成骨效果越好。

1.3.5 骨折大鼠血清炎症因子与骨形成因子检测 大鼠给药后28 d使用戊巴比妥钠进行麻醉，收集腹主动脉血，分离血清，采用ELISA法检测血清中炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）与骨形成因子（ALP和BGP）的含量。

1.3.6 大鼠骨痂组织中NF-κB信号通路BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表达水平检测 采用Western blot法。收集4组大鼠股骨中段处骨痂组织进行蛋白质提取并定量（空白组取相同骨折位置处骨组织），以每个样本20 μg蛋白量依次进行凝胶电泳、转膜、封闭，4℃过夜孵育一抗，一抗浓度为：BMP-2（1:800）、IκB-α（1:800）、IκK-β（1:800）、NF-κB（1:500）、β-actin（1:1 000），室温条件下孵育二抗2 h，漂洗干净后使用ECL试剂盒显影，在凝胶成像系统曝光拍照，以β-actin作为内参反映蛋白表达水平。

2 结果

2.1 酸枣仁皂苷A对大鼠骨折愈合的影响 给药开始后14 d，模型组骨折断端边缘模糊，骨痂量减少，骨密度低；酸枣仁皂苷A低剂量组断端边缘可见，骨痂量增多；酸枣仁皂苷A高剂量组断端边缘可见但接近消失，骨痂量增多。给药开始后28 d，模型组大鼠股骨断端边缘仍不整齐，骨痂量虽有生成但不足以填满缺损；酸枣仁皂苷A低、高剂量组断端边缘均完全消失，骨痂填满缺损并与骨皮质相互连接，见图1。

图1 4组大鼠股骨动物数字化X射线影像系统摄片图（箭头所示为骨折处）

2.2 酸枣仁皂苷A对大鼠骨折组织病理学的影响 给药开始后28 d，空白组股骨未见骨损伤区域，成骨结构完好。模型组股骨骨组织之间可见骨大面积损伤区域，断端周围大量新生骨小梁形成，断端处较多纤维组织增生，见较多成纤维细胞和胞核呈长梭形的纤维细胞，未完全将断端连接，大量炎性细胞浸润，包括核呈圆形深染的淋巴细胞，亦见较多的新生血管形成；酸枣仁皂苷A低剂量组股骨骨组织之间可见骨大面积损伤区域，断端周围较多新生骨小梁形成，断端处较多纤维组织增生，见成纤维细胞和纤维细胞，少量的纤维浆液性物质渗出，较多炎性细胞浸润，以淋巴细胞和浆细胞为主，大量的新生血管形成，轻微出血；酸枣仁皂苷A高剂量组股骨骨组织之间可见损伤区域，面积较小，断端周围较多新生骨小梁形成，断端处多量纤维组织增生，见成纤维细胞和纤维细胞，损伤区域中央见少量软骨细胞形成，少量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。各组大鼠骨痂病理学检查情况见图2（插页）。与空白组相比，模型组大鼠骨痂病理学组织评分明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，酸枣仁皂苷A高、低剂量组骨痂病理学组织评分均升高（均 P＜0.05），见表1。

图2 各组大鼠骨痂病理学检查所见（HE染色）

2.3 酸枣仁皂苷A对骨折大鼠血清中炎症因子的影响 给药开始后28 d，与空白组相比，模型组大鼠血清中 IL-1β、IL-6与 TNF-α 含量均升高（均 P＜0.01）；与模型组相比，酸枣仁皂苷A高剂量组血清中IL-1β、IL-6与TNF-α含量均降低（均P＜0.05），但酸枣仁皂苷A低剂量组降低不明显（均P＞0.05），见表2。

表2 4组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较（ng/L）

2.4 酸枣仁皂苷A对骨折大鼠血清中骨形成因子的影响 给药开始后28 d，与空白组相比，模型组大鼠血清中ALP与BGP含量均下降（均P＜0.01）；与模型组相比，酸枣仁皂苷A高剂量组血清中ALP与BGP含量均升高（均P＜0.05），但酸枣仁皂苷A低剂量组升高不明显（均P＞0.05），见表 3。

表3 4组大鼠血清中ALP与BGP含量比较

2.5 酸枣仁皂苷A对骨折大鼠骨痂组织中NF-κB信号通路各蛋白的影响 与空白组相比，模型组大鼠骨痂中 BMP-2 蛋白表达水平降低（P＜0.01），IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表达水平均升高（均P＜0.01）；与模型组相比，酸枣仁皂苷A高、低剂量组骨痂中BMP-2蛋白表达水平均升高（均P＜0.01），酸枣仁皂苷A高剂量组中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表达水平均降低（均 P＜0.05），但酸枣仁皂苷A低剂量组降低不明显（均P＞0.05），见图 3和表4。

图3 4组大鼠骨痂中骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、NF-κB抑制剂蛋白 -α（IκB-α）、NF-κB 抑制蛋白激酶 -β（IκK-β）、NF-κB蛋白表达的电泳图（β-actin为β-肌动蛋白）

表4 4组大鼠骨痂组织中 BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表达水平比较

3 讨论

近年来，人们为了探索更直接有效的骨折治疗方案，对骨折愈合的过程进行了广泛的研究和了解[6]。骨愈合分为直接愈合和间接愈合，前者是指不受外力影响的自然愈合，后者是指通过治疗手段达到的愈合[7]。动物数字化X线影像系统摄片可以显示骨折的具体情况，直接反映骨折的程度，同时也是判断骨折是否愈合的有效方法之一。本实验通过动物数字化X线影像系统摄片发现，模型组大鼠骨折后14 d骨折愈合速度缓慢，愈合程度低，28 d后仍未完全愈合。而使用酸枣仁皂苷A后，无论是高剂量组还是低剂量组骨折均快速愈合，28 d后基本愈合，说明酸枣仁皂苷A对股骨骨折具有促进愈合的作用。

骨折愈合大致可分为3个阶段：血肿炎症期、骨痂形成期和骨板形成塑型期，炎症期会出现疼痛、组织肿胀和功能障碍等症状，严重的会产生骨裂，所以消除血肿炎症、促进骨痂形成是促进骨折愈合的重要环节[8]。炎症刺激会导致骨组织沉积和纤维细胞不断增殖，使组织血管壁增厚，影响骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，导致骨折延迟愈合[9]。本实验通过对新生骨组织进行HE染色后发现，模型组股骨断端处纤维细胞与炎性细胞聚集明显，28 d后情况未好转，说明血肿炎症期仍在持续。使用酸枣仁皂苷A的两组大鼠28 d后血肿炎症期已经度过，具体表现为炎性细胞减少，骨小梁形成增多，并伴有软骨细胞形成，血清中IL-1β、IL-6与TNF-α含量均明显降低，说明酸枣仁皂苷A能促进骨痂的形成，加快骨折愈合。骨形成是骨折愈合的最后阶段，ALP与BGP都是骨形成的标志。随着成骨细胞的分化成熟，ALP去磷酸化后，磷酸根能与钙离子结合形成磷酸钙帮助骨形成；BGP是骨基质的成分之一，由于骨形成会吸收骨基质，在这个阶段BGP会被释放到血液中，成为反映骨代谢与骨周转率的指标之一[10-11]。BMP在骨折愈合中通过调节细胞内信号通路，发挥刺激组织再生、成骨细胞分化、基因表达和细胞迁移等作用[12]。其中BMP-2会诱导骨髓间充质干细胞释放BGP促进骨基质形成，通过细胞外钙的流入和内质网钙的释放显著增加了钙的浓度，促进磷酸钙的形成[13-14]，因此，BMP与成骨细胞的分化和骨形成有密切的关系。有研究发现，在浓缩间充质干细胞中持续单独或共同传递BMP-2可在体外诱导软骨形成和成骨，并在体内诱导颅骨缺损的软骨再生[15-16]。本实验发现，使用酸枣仁皂苷A后骨痂组织中BMP-2蛋白表达水平升高，说明成骨细胞正在快速分化与成熟，同时血清中ALP与BGP含量均明显升高，说明骨形成正在进行，符合成骨的特征，提示酸枣仁皂苷A能促进骨折愈合。

为了探讨酸枣仁皂苷A是否通过NF-κB通路降低炎症反应来促进骨折愈合，本实验对骨痂中NF-κB信号通路上的 IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表达水平进行了检测，结果发现，使用酸枣仁皂苷A后，IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表达水平均明显降低，说明骨痂组织中NF-κB信号通路被抑制，酸枣仁皂苷A可能通过抑制NF-κB通路来减少血清中IL-1β、IL-6与TNF-α含量，使骨折愈合阶段中血肿炎症期缩短并过渡到骨痂形成期和骨形成期，加速骨折愈合。

综上所述，本实验通过动物数字化X线影像系统摄片与病理学检查明确酸枣仁皂苷A能促进骨折愈合；通过检测血清中IL-1β、IL-6与TNF-α含量与骨痂中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表达水平说明酸枣仁皂苷 A促进骨折愈合的机制是抑制炎症通路，减少炎症因子的释放；最后通过检测血清中ALP与BGP的含量与骨痂中BMP-2的表达明确酸枣仁皂苷A还具有促进骨形成的作用。但由于骨形成阶段所涉及的因子与通路网十分复杂，本实验只着眼于愈合前期的炎症阶段，对酸枣仁皂苷A诱导骨形成的机制尚未深入探讨，今后将设计相应的实验来进一步研究。