抗酸染色全自动显微扫描识别系统的临床应用评价

丁北川 周复 杨新宇 孟宪杰 易俊莉 叶健苗 武文清

抗酸染色显微镜检因易于推广并实施，且具有较高的效益成本比，广泛用于结核病病原学检查。然而，传统的抗酸染色显微镜检结果在各实验室间及专业技术人员间差异较大[1]。随着科学技术的不断发展，国内外利用机器视觉在细胞自动识别和图像分析方面开展了大量的研究，可对细胞进行自动识别和自动筛选的细胞检测和图像分析设备相继推出[2-3]。在分枝杆菌抗酸染色检测方面的相应设备主要包括两个系统：一是实现涂片视野扫描自动调焦显微放大获取图像的平台系统；另一部分是通过判读软件实现抗酸染色显微图像自动识别[4]。笔者选取肺结核患者的痰液标本，应用抗酸染色全自动显微扫描系统(AFB-AS)进行检测，以了解其应用效果。

对象和方法

一、 研究对象

搜集2019年1月至8月于北京结核病控制研究所确诊的462例肺结核患者作为研究对象，每例患者留取3份初诊痰液标本，共计1386份，均进行抗酸染色。每例患者选取2份痰液标本进行分枝杆菌分离培养，共计完成924份；其中1份同时进行GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)检测，共计完成462份。

二、 实验方法

(一)抗酸染色

参照《结核病实验室检验规程》[5]，完成玻片制备和萋-尼抗酸染色操作。

1.传统抗酸染色检查：使用油镜(100×；显微镜型号：OLYMPUS CX41) 阅片。阴性结果及阳性结果分级标准如下：(1)抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。(2)抗酸杆菌阳性：①抗酸杆菌菌数为1～8条/300个视野；②抗酸杆菌阳性(1+)：3～9条/100个视野，连续观察300个视野；③抗酸杆菌阳性(2+)：1～9条/10个视野，连续观察100个视野；④抗酸杆菌阳性(3+)：每个视野1～9条；⑤抗酸杆菌阳性(4+)：每个视野≥10条。

2.AFB-AS：依照系统使用说明(杭州上池科技有限公司提供，型号：MSS-TB-04)，按照传统抗酸染色镜检和结果报告模式，每张待检玻片设定300个连续视野进行扫描。记录下列数据：(1)不经技术人员复核，显微图像经系统软件自动判定为阴性或阳性；(2)技术人员通过观察显微图像的方式，对系统软件提示“阳性”的图像进行复核后判读结果。

3.质量控制：传统抗酸杆菌染色检查报告和AFB-AS检验报告由专业技术人员采用双盲法判读。

(二)培养及核酸检测

按照《结核病实验室检验规程》[5]，使用罗氏培养基完成痰标本分枝杆菌分离培养。使用Xpert进行结核分枝杆菌(MTB)核酸检测。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计数资料以“百分率(%)”描述，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.01为差异有统计学意义。以分枝杆菌分离培养结果为参照，分析不同方法检测肺结核患者痰涂片抗酸杆菌染色的效能，计算公式：敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。方法间一致性检验采用Kappa检验，Kappa值>0.80认为一致性好，Kappa值为0.61～0.80认为一致性较好，Kappa值为0.41～0.60认为一致性一般，Kappa值<0.41认为一致性较差。各方法检测肺结核患者痰涂片抗酸杆菌染色阳性结果的等级相关性采用Spearman相关性检验。

结 果

一、病原学检查结果

以痰标本经传统抗酸杆菌染色镜检、AFB-AS检查、分枝杆菌分离培养或Xpert任一检测结果为阳性，判定为病原学阳性，研究对象病原学阳性率为69.91%(323/462)。各检测方法检测研究对象病原学阳性率从高到低依次为Xpert(69.26%，320/462)、分枝杆菌分离培养(64.29%，297/462)、AFB-AS(61.04%，282/462)、传统抗酸杆菌染色镜检(58.66%，271/462)，差异无统计学意义(χ2=6.958，P=0.031)。

各方法检测痰标本阳性率从高到低依次为Xpert(69.26%，320/462)、分枝杆菌分离培养(43.61%，403/924)、AFB-AS(43.22%，599/1386)、传统抗酸杆菌染色镜检(38.24%，530/1386)。AFB-AS检测痰标本阳性率明显高于传统抗酸杆菌染色镜检，差异有统计学意义(χ2=67.015，P<0.01)。

二、不同镜检方法比较

1386张抗酸染色玻片经传统抗酸杆菌染色镜检和AFB-AS检查(人工复核)均报告阴性结果的玻片有787张，均报告阳性结果的玻片有530张，一致率为95.02%(1317/1386)；69张玻片(4.98%，69/1386)检查结果报告不一致，均为AFB-AS检查(人工复核)报告阳性而传统抗酸杆菌染色镜检报告阴性。两种方法判读阳性等级相关系数(Spearman)为0.954(表1)。

表1 抗酸染色全自动显微扫描系统(人工复核)与传统抗酸杆菌染色镜检判读肺结核患者痰涂片结果对比(张)

1386张抗酸染色玻片经传统抗酸杆菌染色镜检与AFB-AS检查(软件识别)均报告阴性结果的玻片有683张，均报告阳性结果的玻片有530张，一致率为87.52%(1213/1386)。173张玻片(12.48%，173/1386)检查结果报告不一致，均为AFB-AS检查(软件识别)报告阳性而传统抗酸杆菌染色镜检报告阴性。两种方法判读阳性等级相关系数(Spearman)为0.898(表2)。

表2 抗酸染色全自动显微扫描系统(软件识别)与传统抗酸杆菌染色镜检判读肺结核患者痰涂片结果对比(张)

1386张抗酸染色玻片经AFB-AS检查(人工复核)和AFB-AS检查(软件识别)均报告阴性结果的玻片有683张，均报告阳性结果的玻片有599张，一致率为92.50%(1282/1386)。104张玻片(7.50%，104/1386)检查结果报告不一致，均为AFB-AS软件识别为阳性，而图像经人工复核后排除。AFB-AS检查(人工复核)和AFB-AS检查(软件识别)判读阳性等级相关系数(Spearman)为0.942(表3)。

表3 抗酸染色全自动显微扫描系统软件识别与人工复核判读肺结核患者痰涂片结果对比(张)

三、 各方法检测效能分析

924份痰标本同时完成分枝杆菌分离培养、传统抗酸杆菌染色镜检和AFB-AS检查，阳性率分别为43.61%(403/926)、41.47%(384/926)和46.44%(430/926)。培养阳性率明显高于传统抗酸杆菌染色镜检，低于AFB-AS检查，差异均有统计学意义(χ2值分别为4.985、9.986，P值均<0.01)。以分枝杆菌分离培养结果为参照标准，AFB-AS检查肺结核患者痰标本敏感度为94.29%，高于传统抗酸杆菌染色镜检的敏感度(89.58%)，见表4。

表4 传统抗酸杆菌染色镜检和抗酸染色全自动显微扫描系统检测以培养结果为参照标准检测肺结核患者痰标本的效能

四、 各方法检测差异分析

462份标本同时完成抗酸杆菌染色、分枝杆菌分离培养和Xpert检测，其中，23份标本抗酸杆菌染色阳性(包括传统抗酸杆菌染色镜检和AFB-AS)但培养阴性。传统抗酸杆菌染色镜检阳性而培养阴性的标本，经Xpert检测后阳性者占8/9，高于AFB-AS检查阳性而培养阴性标本的比例(21.43%，3/14)，差异有统计学意义(χ2=9.991，P<0.01)。

讨 论

随着科学技术的不断发展和高度结合，已有多个厂家针对抗酸染色检查推出自动化涂片、自动化染色等设备。相关设备在提高抗酸染色涂片质量、缩短检测周期、提高病原学阳性率、降低人力资源依赖程度、减少生物安全风险等方面，均发挥一定作用。AFB-AS可以对抗酸杆菌染色镜检图像进行自动提取、智能识别，进而部分降低相应检查项目对从业人员经验的依赖程度, 同时也减轻了操作者的劳动强度。

本研究结果显示，AFB-AS检测肺结核患者痰涂片的阳性率明显高于传统抗酸杆菌染色镜检，并且对于低阳性级别痰标本，与传统抗酸杆菌染色镜检比较，AFB-AS对检出抗酸杆菌具有一定的优势。因此，AFB-AS检测肺结核患者痰涂片的敏感度也高于传统抗酸杆菌染色镜检；但其检测特异度低于传统抗酸杆菌染色镜检。尽管两种检测方法的敏感度和特异度存在差异，但两种方法对痰涂片抗酸杆菌判读报告的等级相关系数为0.954，且均与分枝杆菌分离培养法具有较高的一致性。对于AFB-AS投入常规使用后，操作者需要注意的是，鉴于其识别抗酸杆菌的特异度低于传统抗酸杆菌染色人工镜检，对于抗酸杆菌较少的玻片，有必要使用传统镜检模式进行复检。本文的结果及观点与相关文献报道一致[6-9]。

传统抗酸杆菌染色镜检与AFB-AS的结果差异，主要出现在前者检测阴性而后者检测阳性的标本上，表现在AFB-AS能够在部分含抗酸杆菌量较低的标本中实现对目标菌的检出。这提示我们该系统研发者的初衷，似乎是尽可能减少“漏报”。在本研究中，AFB-AS检测阳性而培养阴性的标本，经Xpert检测验证的结果，能够支持此推论。当然，这也说明AFB-AS在显微放大倍数、抗酸杆菌软件识别、抓取图像分辨率、目标图像识别算法等方面，仍有进一步提升的空间。

与AFB-AS实际投入应用的场景比较，本研究在设计及实施过程中存在一定缺陷。本次研究未纳入非结核病患者样本进行对照，仅针对肺结核患者痰标本的检测结果进行了分析。因此，AFB-AS的实际应用性能，有待进一步验证。同时，本文未对AFB-AS投入使用后，相应项目实施的人工成本、经济成本进行比较分析；而针对其投入使用后，如何完善相关项目的质量保障和质量控制措施，有待进一步讨论。

综上，本研究结果表明，AFB-AS的检测性能能够满足抗酸杆菌萋-尼染色临床检验项目的要求。鉴于日常工作中，肺结核患者痰涂片抗酸杆菌染色镜检的阳性结果报告比例较低，而传统阅片方法工作人员劳动负荷较大，加之AFB-AS可减少“漏报”的设计初衷，AFB-AS的推广应用，能够在一定程度上减少工作负荷与人员数量、报告时效之间的矛盾的同时，能够降低对判读人员经验的依赖程度。