分子药物敏感性试验对复治涂阳肺结核患者化疗的指导及效果分析

刘轾彬 吴敏 吴小翠 韩敏 张青 沙巍

我国结核病尤其是耐药结核病防控形势依然严峻[1]，复治肺结核耐药率远高于初治肺结核[2-3]，从复治肺结核患者中快速检出耐药结核分枝杆菌，指导临床选择有效的抗结核药物，制定合理的化疗方案，是治疗复治及耐药结核病的关键[4]。目前，临床广泛应用的传统表型药物敏感性试验(drug susceptibility testing，DST)耗时较长，不能为临床提供时效性检测结果[5-6]；分子DST在1～2 d内即可报告结果，越来越受到重视。本研究采用PCR-反向点杂交法进行分子DST检测，通过前瞻性随机对照的方法，探讨分子DST对复治涂阳肺结核患者化疗的指导及效果。

对象和方法

一、研究对象

收集2016年3月至2020年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者作为研究对象，包括初治失败、规则用药满疗程后痰菌复阳、不规律化疗超过1个月及慢性排菌的患者；排除就诊前已接受耐多药方案治疗的患者，以及恶性肿瘤、HIV感染或艾滋病、长期使用激素或免疫抑制剂、妊娠或哺乳期的患者。本研究通过本院伦理审查委员会的审批，所有患者均签署知情同意书。

所有患者均定期于我院住院或门诊随访，收集每例患者的痰液或支气管肺泡灌洗液，每份标本量不少于3 ml，经涂片荧光染色镜检，收集抗酸杆菌阳性标本共400份。所有标本均行分枝杆菌培养，培养阳性且鉴定为MTB的分离株采用微孔板法进行表型DST，按就诊时间顺序依随机数字表法对其中200例患者的同一份标本采用PCR-反向点杂交法进行分子DST。行PCR-反向点杂交法患者与未行PCR-反向点杂交法患者性别、年龄及复治类型的差异均无统计学意义(P值均>0.05)，见表1。

表1 不同临床特征在行PCR-反向点杂交法患者与未行PCR-反向点杂交法患者中的分布情况

二、研究方法

1.微孔板法DST：将涂片阳性标本经N-乙酰左旋半胱氨酸-氢氧化钠消化液处理15 min，加入磷酸盐缓冲液至40 ml，4 ℃ 3000×g离心20 min，弃上清液，沉淀加入2 ml 磷酸盐缓冲液振荡重悬。取0.5 ml上述重悬液，按《结核病实验室检验规程》[7]进行BACTEC MGIT 960液体培养，培养阳性菌株应用对硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培养基生长试验进行菌种鉴定，鉴定为MTB的分离株采用美国赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)的分枝杆菌药敏检测板Sensititre®MYCOTB进行表型DST检测，具体操作方法按照说明书进行，其中，异烟肼(H)和利福平(R)耐药浓度分别为0.2 μg/ml和1 μg/ml。

2.PCR-反向点杂交法DST：取1 ml上述重悬液，应用亚能生物技术(深圳)有限公司的MTB耐药突变基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)检测H耐药相关基因katG的315位点和inhA的-15位点以及R耐药相关基因rpoB的516、526、531位点，具体操作方法及结果判读按照说明书进行，对阴性或无法判读结果者采用PCR-反向点杂交法进行分枝杆菌菌种鉴定。

三、治疗方案

培养或PCR-反向点杂交法鉴定为非结核分枝杆菌的患者按NTM肺病治疗，其他患者治疗方案如下：微孔板法结果回报前，PCR-反向点杂交法检测为H和(或)R耐药的患者予H和(或)R耐药化疗方案，其余患者予H、R敏感复治化疗方案；微孔板法结果回报后，以微孔板法结果为标准调整化疗方案。化疗方案的制定原则符合WHO和中国防痨协会制定的相关指南[3,8]。

四、 近期疗效观察指标及评价

化疗方案中未调整H和(或)R的患者，于治疗前、微孔板法结果回报时及治疗3、6、9、12个月末，行痰抗酸杆菌涂片及分枝杆菌培养；化疗方案中调整H和(或)R的患者，于治疗前、微孔板法结果回报时及根据微孔板法结果调整化疗方案后3、6、9、12个月末，行痰抗酸杆菌涂片及分枝杆菌培养。以痰菌阴转率为评价近期疗效的主要指标，按照中华医学会《临床诊疗指南结核病分册》[9]制订的标准，痰菌阴转指连续2次痰涂片或培养阴性(至少间隔30 d)，且不再复阳。

五、统计学处理

结 果

一、微孔板法确诊的利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)患者的临床特征

微孔板法共确诊RR-TB患者114例，58例行PCR-反向点杂交法患者与56例未行PCR-反向点杂交法患者治疗前及本次治疗的各项临床特征的差异均无统计学意义，见表2。

表2 不同临床特征在微孔板法确诊的利福平耐药结核病患者中的分布情况

二、微孔板法结果回报时RR-TB患者中行PCR-反向点杂交法与未行PCR-反向点杂交法患者的痰涂片抗酸杆菌情况比较

微孔板法结果回报时，RR-TB患者中行PCR-反向点杂交法患者与未行PCR-反向点杂交法患者的痰涂片抗酸杆菌阴转率分别为18.9%(10/53)和5.9%(3/51)，前者高于后者，差异有统计学意义；两者痰涂片阳性标本抗酸杆菌分级计数分布存在差异，行PCR-反向点杂交法患者痰标本荷菌量更少，差异有统计学意义，见表3。

表3 微孔板法结果回报时利福平耐药结核病患者的痰涂片抗酸杆菌镜检情况比较

三、应用利福平耐药方案治疗后RR-TB患者中行PCR-反向点杂交法与未行PCR-反向点杂交法患者的痰菌阴转率比较

部分患者在部分时段中断治疗或因咳痰症状缓解导致无痰或无法获得合格痰标本，能够留取合格痰标本进行痰检的RR-TB患者在应用利福平耐药方案治疗后的不同时间点痰涂片或培养的阴转情况见表4。结果显示，行PCR-反向点杂交法患者与未行PCR-反向点杂交法患者在应用利福平耐药方案治疗3、6、9、12个月末痰菌阴转率差异均无统计学意义。

表4 应用利福平耐药方案治疗后的不同时间点利福平耐药结核病患者痰菌阴转率的比较

讨 论

结核病患者体内通常敏感菌和耐药菌并存，只是所占比例不同[10]，一般初治患者敏感菌比例高于耐药菌，部分患者因各种原因由初治转变为复治时，随着敏感菌株被逐渐杀灭，耐药菌株逐渐占优势，因此成为耐药结核病高危人群。耐药结核病发现的延迟和不精准的复治化疗方案，不仅不利于复治结核病患者自身的早日康复，还可能导致患者对更多抗结核药物发生耐药以及耐药MTB的进一步传播[11]。近年来分子DST检测技术的发展有助于解决上述问题。

Jeon等[12]报道了分子DST对耐多药结核病治疗起始时间的影响，研究发现复治、GeneXpert MTB/RIF和分子线性探针检测是耐多药结核病起始治疗时间的独立影响因素，复治结核病将推迟耐多药结核病起始治疗时间，而分子DST可使起始治疗时间提前。本研究显示，微孔板法确诊的RR-TB患者中，行PCR-反向点杂交法的患者在微孔板法结果回报时，痰涂片抗酸杆菌阴转率明显上升，痰涂片阳性标本荷菌量明显下降，提示行PCR-反向点杂交法的患者能在时间上更早获得痰菌情况的改善，原因是PCR-反向点杂交法能更快发现耐药，接受PCR-反向点杂交法指导制定化疗方案的患者能更早启动耐药治疗方案。

本研究显示，微孔板法确诊的RR-TB患者中行PCR-反向点杂交法者与未行PCR-反向点杂交法患者在应用利福平耐药方案治疗3、6、9、12个月末痰菌阴转率差异无统计学意义，提示两者近期疗效无差别。埃塞俄比亚的一项研究评价了耐药结核病患者中基于基因型的诊断算法对治疗启动时间和治疗结果的影响，研究发现GeneXpert MTB/RIF可通过快速诊断和治疗启动明显缓解耐药肺结核的传播，其次是分子线性探针，特别是在涂片阳性的患者中；但是就治疗结果而言，与基于固体培养的DST相比，3种检测方法差异无统计学意义[13]。Shi等[14]报道，在中国江苏和四川两家医院进行的一项队列研究显示，与未行分子DST检测的对照组相比，MTBDRsl/MTBDRplus法DST检测组耐多药结核病诊断时间明显缩短，痰培养阴转时间更快，治疗成功率更高。分子DST 指导的精准治疗可以提高耐药结核病患者的治疗成功率。

分子DST 指导的精准治疗不仅可以提高耐药结核病患者的疗效，还可以减少更多抗结核药物发生耐药及降低不良反应发生率。Romanowski等[15]的研究显示，与痰涂片及GeneXpert MTB/RIF相比，分子线性探针对异烟肼耐药、利福平敏感结核病的准确诊断和量身定制的治疗使获得性耐多药结核病相对减少了近50%。另一项多中心开放随机对照临床研究在GeneXpert MTB/RIF 确诊的RR-TB患者中通过快速培养获得MTB分离株后，采用全基因组测序技术对吡嗪酰胺进行耐药性检测从而优化超短程化疗方案，结果显示，开始治疗后的84 周内病情持续好转且无反复，痰培养阴转时间缩短，不良事件发生率下降[16]。

尽管分子DST以其快速、简便、高效的优点可以在耐药结核病的早期诊断和化疗方案的合理制定方面发挥重要作用，但是也要充分认识到不同抗结核药物的分子DST可靠性不同，且不同分子DST检测方法的敏感度和特异度也存在差异[17]。PCR-反向点杂交法是将高敏感度的PCR技术和高通量的反向点杂交技术相结合的基因检测技术，已有研究报道该方法对复治涂阳肺结核患者的临床标本中MTB的H、R耐药性具有较好的检测效能[18]。但本研究中，PCR-反向点杂交法对微孔板法确诊的单耐H结核病的敏感度较低，故本研究未对微孔板法确诊的单耐H肺结核患者的疗效进行分析。因此，目前在分子DST和表型DST均无法满足临床既要保证较高敏感度又要兼顾时效性的实际需求的情况下，建议联合检测以保障耐药结核病高危人群获得更大的收益。

本研究的局限在于PCR-反向点杂交法敏感度不够高且存在假阳性现象，未对肺部影像学变化及远期疗效进行观察及评价。未来将选择敏感度和特异度更高的分子生物学方法或多种分子生物学方法联合检测；另外，要进一步扩大样本量，观察及评价肺部影像学变化和远期疗效；开展其他抗结核药物特别是二线核心药物的分子DST检测。