肺泡灌洗液LAMP在下呼吸道感染病原体检测中的应用

王南，宋银森

(河南中医药大学人民医院/郑州人民医院 转化医学研究中心，河南 郑州 450014)

下呼吸道感染是最常见的感染性疾病，具有较高的发病率和死亡率[1]。及时进行下呼吸道感染病原体检测有助于临床准确诊断及合理用药，对控制感染发挥至关重要的作用。传统病原体检测方法包括涂片镜检、细菌培养和血清学试验等，这些方法操作繁琐、灵敏度及特异性不足，其中细菌培养需严格环境条件且耗时较长[2-3]。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)在对单靶标核酸检测时，具有灵敏度和特异性高的特点，但每次仅能检测1种病原体，效率低并且成本较高[4-5]。近年来，环介导恒温扩增法(loop mediated isothermal amplification，LMAP)作为一种操作简便、快速准确且经济的分子诊断技术，可同时并行检测多种核酸靶基因，被广泛应用于病原体检测[6-9]。本研究分析下呼吸道感染患者肺泡灌洗液的病原体检出情况，评价肺泡灌洗液LAMP在下呼吸道感染病原体检测中的价值，为临床及时准确鉴定病原体提供一种可靠的诊断依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020年4月至2021年4月于郑州人民医院就诊的465例疑似下呼吸道感染患者，标本类型为肺泡灌洗液，其中男281例，女184例，年龄13～95岁，平均(61.82±18.20)岁。(1)纳入标准：①以发热、咳嗽、呼吸困难及肺部感染等为主要临床表现，诊断标准参照《医院感染管理规范》[10]；②胸部X片或者CT等影像学结果提示下呼吸道感染。(2)排除标准：①标本镜检不合格培养出的菌株；②因非感染因素导致的下呼吸道影像学改变，如肺水肿、肺癌及心力衰竭等。

1.2 核酸提取及LAMP检测核酸提取步骤参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书(北京博奥)。呼吸道病原菌核酸检测试剂盒采用恒温扩增技术，结合微流控碟式芯片，利用荧光染料掺入法在分析仪上进行恒温(65 ℃)反应和实时荧光分析，在具有链置换功能的聚合酶作用下，阳性样本扩增曲线呈类似“S”形，通过 RTisochipTM-A 恒温扩增微流控芯片核酸分析仪(北京博奥)和配套软件分析并进行结果判读，可同时检测多种病原体核酸靶基因。

1.3 细菌分离培养及鉴定标本接种培养及菌种鉴定按照《全国临床检验操作规程》进行操作，用VITEK-32全自动细菌分析仪(法国梅里埃)对纯培养后的优势菌落进行鉴定。

1.4 统计学方法应用SPSS 25.0软件进行统计分析，计数资料用百分数表示；采用McNemarχ2检验分析LAMP法与细菌培养法检测结果阳性率的差异，P<0.05为差异有统计学意义；两种检测方法结果一致性分析采用Kappa分析，Kappa>0.4表明结果具有一致性。

2 结果

2.1 LAMP检出病原体的分布情况465例患者肺泡灌洗液标本中，LAMP检出阳性171例，阳性率为36.77%(171/465)，其中单一病原体感染116例，混合感染55例，分别占总感染阳性例数的67.84%和32.16%。感染病原体以耐甲氧西林葡萄球菌(11.40%)和鲍曼不动杆菌(9.25%)为主，其他病原体阳性率较高的有肺炎克雷伯菌(8.60%)、铜绿假单胞菌(7.10%)、结核分枝杆菌复合菌(5.59%)、嗜肺军团菌和肺炎支原体阳性率最低均为0.22%。单一病原体感染中结核分枝杆菌复合菌(92.31%)和肺炎链球菌(82.35%)阳性率较高。在耐甲氧西林葡萄球菌阳性病例中，单一感染和混合感染占比大致相等，而以金黄色葡萄球菌为主的混合感染病例占90.91%。见表1。

表1 LAMP对病原体的检出情况

2.2 细菌培养结果465例患者肺泡灌洗液标本中，细菌培养结果检出91例阳性，阳性率为19.57%(91/465)。各病原体检出阳性率较低，其中鲍曼不动杆菌(8.39%)、肺炎克雷伯菌(7.53%)、铜绿假单胞菌(4.95%)和金黄色葡萄球菌(1.94%)占比较高，未培养出流感嗜血杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌和嗜肺军团菌。见表2。

表2 细菌培养鉴定结果

2.3 LAMP检测和细菌培养对病原体检出率的比较465例患者的肺泡灌洗液标本，LAMP检出阳性171例，阴性294例，阳性率为36.77% (171/465)；细菌培养结果为91例阳性，374例阴性，阳性率19.57%。肺泡灌洗液LAMP检出阳性率高于细菌培养法，差异有统计学意义(χ2=69.344，P<0.001)。

2.4 LAMP和细菌培养对病原体检测结果一致性分析在171例LAMP检测为阳性的样本中，86例细菌培养结果阳性；在294例LAMP检测阴性的样本中，有5例样本细菌培养结果阳性。两种方法在病原体检测中有375例样本结果一致，一致率为80.65%(375/465)，其中鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌的一致性较好，Kappa值分别为0.813、0.810、0.769和0.725。见表3。

表3 LAMP检测与细菌培养对病原体检测结果一致性分析

3 讨论

下呼吸道感染是最致命的疾病之一。据统计，2016年下呼吸道感染导致5岁以下儿童死亡人数约65万，所有阶段的成年人死亡人数高达238万[11]。LAMP检测采用多指标并行检测，能够减少污染并且具有高灵敏度和低检测限等优点，实现了病原体的快速诊断[12-15]。本研究中肺泡灌洗液LAMP检测阳性率高于细菌培养阳性率，与以往研究[16]一致，说明采用肺泡灌洗液LAMP检测方法可以提高病原体的检出率，在临床应用中更具一定的优势。

合格的样本是下呼吸道感染病原体准确检测的关键。痰液作为最主要且最容易获取的标本很容易被上呼吸道正常菌群影响，并且整个长时间培养过程中也易被污染[17-18]。此外患者进行该检测前使用抗菌药物也会降低阳性检出率[19]。但是，上呼吸道正常菌群污染无法避免，结果应结合标本来源与疾病情况等综合考虑判断。与痰液相比，肺泡灌洗液较少受上呼吸道正常菌群的污染，取得样本质量更高，检出率及合格率也更高[20]。因此，基于肺泡灌洗液标本类型检测感染病原体核酸可能会更准确地评估LAMP的检测性能，为临床准确区分定植菌与致病菌提供更可靠的诊断依据。本研究结果显示，肺泡灌洗液LAMP和细菌培养法检测病原体结果一致率为80.65%，其中鲍曼不动杆菌(Kappa=0.813)、铜绿假单胞菌(Kappa=0.810)、金黄色葡萄球菌(Kappa=0.769)及肺炎克雷伯菌(Kappa=0.725)的一致性较好。与既往相关研究[19,21-29]相比，肺泡灌洗液LAMP检测与细胞培养结果的一致性较好，提示肺泡灌洗液LAMP检测可作为下呼吸道感染病原体诊断的最适方案。

本研究结果也显示，171例肺泡灌洗液LAMP检测为阳性，85例细菌培养结果阴性；有5例肺泡灌洗液细菌培养为阳性，而LAMP检测结果为阴性。产生上述结果的原因可能是样本中细菌在培养过程中出现死亡，导致培养结果阴性；其次，样本中病原体核酸水平太低未达到检测限可能会出现结果假阴性，或者非特异性扩增导致结果假阳性；另一方面，LAMP检测可能会遗漏一些特殊病原体，并且已开发的相关检测试剂盒包含检测的病原体种类有限。

引起下呼吸道感染的病原体比较复杂，临床患者会存在单一感染和复合感染，且症状也基本相似，传统的细菌培养很难准确诊断，LAMP则可以同时检出多种病原体。本研究结果显示，单一感染中主要以耐甲氧西林葡萄球菌(11.40%)和鲍曼不动杆菌(9.25%)为主，38.01%的感染为混合感染，其中以金黄色葡萄球菌为主的混合感染占90.91%，在耐甲氧西林葡萄球菌阳性病例中，单一感染和混合感染的比例相近。这也进一步提示LAMP检测结果可作为对细菌培养结果的补充，有助于临床考虑混合感染的可能性，减少抗生素的不合理应用。

综上所述，肺泡灌洗液LAMP检测可以提高下呼吸道感染病原体的检出率，当细菌培养无法检测到患者体中病原体情况下，肺泡灌洗液LAMP可作为一种快速有效的检测方法确定病原体种类，为临床诊疗提供有价值的参考。