基于DLL4/Notch1信号通路的麦粒灸对薄型子宫内膜大鼠血管生成的影响

沈真如，金纯纯，席瑾，刘静玉，潘妍，李茜，程洁，沈洁，夏有兵，2，穆艳云

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.徐州医科大学，江苏 徐州 221004

薄型子宫内膜目前尚无明确定义，一般将排卵后期经阴道超声检查子宫内膜厚度不足7 mm 作为标准[1-2]。而子宫内膜厚度不足可导致子宫内膜容受性降低，子宫内膜容受性是胚胎着床过程中的重要因素[3]。Momeni 等[4]研究发现，当子宫内膜厚度≤7 mm时，胚胎植入率降低。内分泌失调、人工流产导致子宫内膜损伤增多，薄型子宫内膜也越发常见，临床可表现为月经减少、闭经、不孕或反复流产等[5]。目前，临床多采用雌激素、低剂量阿司匹林等治疗方法，但效果欠理想，且有一定不良反应[6]。麦粒灸作为一种传统中医艾灸疗法，具有促进组织修复、整体调节的优点，还能进一步激活机体防御系统，产生持久及多方面的调节作用，可弥补西药治疗的不足，减轻其不良反应[7]。血管生成受损和子宫血流量减少被认为是薄型子宫内膜形成的原因[8]。血管生成是女性生殖系统周期性变化的关键因素，除子宫内膜生长外，还包括黄体形成和卵泡发育[9]。Hahajan 等[10]报道，薄型子宫内膜病理生理特征可能与子宫动脉血流阻抗增加、血管内皮生长因子（VEGF）水平降低有关。VEGF、血管生成素-2（Ang-2）与子宫内膜厚度密切相关[11]。Notch 信号通路在胚胎发生、器官发育、血管生成中发挥重要作用，DLL4 是众多Notch 配体中具有血管内皮细胞特异性的配体，是Notch 信号通路中调节血管生成的关键分子[12-13]。艾灸温热刺激可舒张血管，增加远端血管的血流量[14]。本实验基于DLL4/Notch1信号通路观察麦粒灸对薄型子宫内膜大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2 表达及血管生成的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF 级雌性SD 大鼠30 只，体质量（180±20）g，8～12 周龄，南京中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（沪）2018-0006。饲养于温度（22±2）℃、相对湿度40%～60%环境，光照12 h，正常摄食饮水，适应性饲养1 周。每日上午固定时间进行大鼠阴道脱落细胞涂片，观察其动情周期，待出现一个完整、正常动情周期后开始实验。按随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、麦粒灸组，每组10 只。实验操作遵循《关于善待实验动物的指导性意见》，经南京中医药大学伦理委员会审查批准（202004A017）。

1.2 主要试剂与仪器

VEGF 抗体（货号19003-1-AP）、Ang-2 抗体（货号24613-1-AP），美国Proteintech 公司；Notch1 抗体（货号3608S），美国CST 公司；DLL4 抗体（货号ab183532），英国Abcam 公司；β-tubulin 抗体（货号AB0039）、HRP 标记山羊抗兔IgG（货号AB0101），中国Abways 公司；HRP 标记兔抗山羊IgG（货号A21030），亚科因（武汉）生物技术有限公司；RIPA裂解液（货号P0013B），上海碧云天生物技术有限公司；HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix（货号11201ES03），上海翊圣生物科技有限公司；HE 染色试剂盒（货号C0105），上海碧云天生物技术有限公司。吸入式气体麻醉机（R550），深圳瑞沃德生命科技有限公司；石蜡组织包埋机（Tissue-Tek），日本Sakura公司；石蜡切片机（RM2235），德国Leica 公司；电泳仪（1645050），美国Bio-Rad 公司；实时荧光定量PCR 仪（Agilent Mx3000P），美国StrataGene 公司。

1.3 造模

参照文献[15-16]方法造模。取动情期SD 大鼠，采用吸入式气体麻醉机麻醉，仰卧位固定，腹部手术区备皮，常规消毒后，下腹部正中纵行切口（距耻骨联合上约2 cm），长约2.5～3 cm，打开腹腔，无齿镊轻轻将大鼠左侧子宫拉直，用0 号缝合线活结结扎子宫近卵巢及近阴道端。无菌纱布垫于子宫周围，于子宫颈上方0.5 cm 处用1 mL 注射器缓慢注入95%乙醇，使子宫保持充盈状，针头停留2 min，缓慢吸出95%乙醇，轻轻挤压残留液体，生理盐水冲洗1～2次，无菌纱布将冲洗液擦干，回纳子宫，为防止粘连，再用生理盐水冲洗腹腔1～2 次，逐层缝合后碘伏消毒。术后连续3 d 肌内注射青霉素（8 万U/只）预防感染。手术后密切观察大鼠精神状态、食纳情况。

1.4 干预

参照《实验针灸学》[17]定位，选取“关元”“子宫”（双侧）。麦粒灸组自造模次日起予麦粒灸治疗，大鼠麻醉后腹部备皮，于施灸处涂抹适量凡士林，将麦粒型艾炷（约5 mg/壮）置于穴位处，用线香将其点燃，待大鼠施灸部位出现短暂收缩动作时移去剩余艾绒，每穴7 壮，1 次/d。对照组及模型组只麻醉固定15 min。严格规范执行各项操作，连续干预3 个动情周期（约15 d）。

1.5 取材

实验结束后，颈椎脱臼处死大鼠，开腹取子宫，观察子宫形态。取部分子宫组织，4%多聚甲醛固定，剩余子宫组织置于冻存管内，-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 指标检测

1.6.1 HE 染色

4%多聚甲醛固定大鼠子宫组织，石蜡包埋，切片（4 μm），行HE 染色，镜下观察大鼠子宫内膜形态。每个子宫组织随机选取1 张切片，Image J 图像处理软件测定大鼠子宫内膜厚度（子宫内膜肌层交接处至宫腔的垂直距离），随机选取4 个视野，以平均值作为该子宫组织内膜厚度。统计每张切片血管及腺体数目。

1.6.2 免疫组化染色

取大鼠子宫组织切片烘干，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢溶液浸泡10 min，灭活内源性过氧化物酶；PBS 浸洗后，抗原修复，自然冷却至室温；1%BSA 封闭1 h，滴加VEGF、Ang-2 一抗（1∶50），4 ℃孵育12 h；次日复温并用PBS 浸洗，滴加二抗，孵育30 min；PBS 浸洗，DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。显微镜下观察并拍照，每张切片随机选取4 个视野，Image Pro Plus 图像处理软件测定VEGF、Ang-2 的平均光密度（MOD）。

1.6.3 Western blot 检测

取大鼠子宫组织，冰上刮取子宫内膜，加入适量预冷的RIPA 裂解液，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液测定蛋白浓度；蛋白样品经8% SDS-PAGE 进行电泳，转膜，5%BSA 封闭1 h；加入Notch1（1∶1 000）、DLL4（1∶1 000）、β-tubulin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育12 h；TBST 洗膜后加入二抗，室温孵育1 h；TBST 洗膜3 次，暗室中曝光显影，以β-tubulin 为内参，采用Image J 图像处理软件测定Notch1、DLL4 蛋白相对表达量。

1.6.4 RT-qPCR 检测

提取大鼠子宫内膜组织总RNA，根据反转录试剂盒合成cDNA。按试剂盒说明书进行荧光定量PCR检测。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计与合成，见表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS21.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，多组间比较采用方差分析，Levene 检验方差齐性，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnet’s T3法；不服从正态分布用非参数统计的秩和检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麦粒灸对模型大鼠子宫内膜形态的影响

对照组大鼠动情期子宫组织结构完整，子宫内膜腺上皮及腔上皮细胞形态正常，呈单层立方状，腺体密集、血管丰富；模型组大鼠动情期子宫组织结构不完整，子宫壁全层变薄，腺上皮及腔上皮细胞多呈扁平、低柱状，内膜组织血管稀疏、腺体减少；麦粒灸组大鼠动情期子宫组织结构基本完整，子宫内膜表面呈波浪形，腺上皮及腔上皮细胞形态较为正常，腺体较少，部分区域新生毛细血管增多。见图1。与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜厚度明显变薄，腺体数及血管数目明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，麦粒灸组大鼠子宫内膜厚度增加，腺体数及血管数目明显增多（P＜0.05，P＜0.01）。见图2。

图1 各组大鼠子宫内膜形态（HE 染色）

图2 各组大鼠子宫内膜厚度、腺体数及血管数目比较（，每组5只）

2.2 麦粒灸对模型大鼠子宫内膜组织血管内皮生长因子、血管生成素-2蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，麦粒灸组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见图3～图5。

图4 各组大鼠子宫内膜组织Ang-2 阳性表达（免疫组化染色）

图5 各组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2蛋白表达比较（，每组5只）

2.3 麦粒灸对模型大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，麦粒灸组大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6、图7。

图6 各组大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4蛋白免疫印迹图

图7 各组大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4 蛋白表达比较（，每组5只）

2.4 麦粒灸对模型大鼠子宫内膜组织血管内皮生长因子、血管生成素-2、Notch1、DLL4 mRNA 表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA 表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，麦粒灸组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图8、图9。

图8 各组大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2mRNA 表达比较（，每组5只）

图9 各组大鼠子宫内膜组织Notch1、DLL4 mRNA 表达比较（，每组5只）

3 讨论

子宫内膜是一个复杂的动态组织，包括基底层和功能层，排卵后螺旋动脉血管收缩，流向功能层血液减少，减少氧张力有助于胚胎植入[18]。当子宫内膜变薄时，胚胎植入更靠近基底层，具有更多的血流和较高的氧张力，从而导致活性氧产生，不利于胚胎的发育和植入[19]。研究显示，子宫内膜过薄会影响子宫内膜容受性并显著降低胚胎着床率[20-21]。

VEGF和Ang-2是促进血管生成的重要因子。血管生成是行经后子宫内膜再生的必需过程，对子宫内膜容受性也起着至关重要的作用[22]。许多血管生成因子已被证实与子宫内膜血管的发育和分化有关。VEGF 是包括子宫内膜在内的多种组织中血管生长和重塑的关键介质，可直接作用于血管内皮细胞，促进新生血管形成[23-24]。Takasaki 等[25]推测，薄型子宫内膜血管发育不良可能由于子宫内膜VEGF水平较低，影响子宫内膜容受性。Ang-2作为促进血管形成的重要因子之一，能与血管内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体结合，进而影响血管的稳定性，且与VEGF密切相关[26]。万秋园等[27]研究表明，益母草总生物碱可增加薄型子宫内膜大鼠VEGF、Ang-2的表达，促进子宫内膜血管生成，改善子宫内膜厚度。

DLL4/Notch1信号通路在子宫内膜细胞、胚胎、胎盘组织中均有调控血管发育的作用[12]。Notch 通路参与调节多种细胞的分化和发育，在胚胎发育、细胞增殖分化、肿瘤转移、干细胞分化调节等方面扮演重要角色[13]。DLL4是一种跨膜蛋白，作为Notch配体DLL4基因缺失会导致胚胎和产后血管发育严重异常[28]。研究发现，在反复着床失败患者的子宫内膜中Notch1表达降低可能抑制VEGF受体（VEGFA）活性，使VEGFA 和DLL4/Notch1的平衡状态被打破，最终导致胚胎反复种植失败[29]。

麦粒灸属直接灸，其灼热、灼痛感穿透性明显。灸法可通过激发经气起到整体调节作用，具有温经通络、活血散瘀等功效，还能调节机体免疫功能[30]。关元为任脉穴，又为足三阴经交会穴，还与胞宫、冲脉、督脉联系密切，具有补肾固本、通调阴阳、和血理冲任之效。研究表明，艾灸关元等穴可有效促进子宫动脉血流，改善子宫内膜发育情况，提高妊娠率[31]。子宫属经外奇穴，为子宫在腹部的体表投影，艾灸该穴可起到温煦子宫、改善子宫血流的作用[32]。本课题组前期研究发现，麦粒灸可提高薄型子宫内膜大鼠子宫内膜容受性相关因子同源框转录因子HOXA10、白血病抑制因子、波形蛋白、角蛋白和VEGF 表达，改善大鼠子宫内膜形态，诱导血管再生，调节大鼠子宫内膜微环境[33]。

本实验结果显示，95%乙醇宫腔注射后，大鼠子宫结构不完整，腺体稀疏萎缩，血管数量减少，子宫内膜显著变薄，子宫内膜组织VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表达显著降低，与血管生成相关的Notch信号通路Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平显著下调，提示造模后血管生成严重受损。麦粒灸“关元”“子宫”可改善薄型子宫内膜大鼠宫腔形态，促进上皮细胞与间质细胞生长，增加子宫内膜厚度及腺体和血管数目，显著提高大鼠子宫内膜组织VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表达，促进血管生成。进一步探讨其机制发现，麦粒灸可上调Notch信号通路相关分子Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平。本实验初步探讨麦粒灸对薄型子宫内膜大鼠血管生成的影响，从DLL4/Notch1信号通路分析其可能的作用机制，而VEGF与Notch信号通路在血管生成过程中的相互作用及机制还需今后进一步研究。