不同核质蛋白分离条件对研究核转位分子的分布的影响#

辜雷燕 郭丽娟 刘晴蓉 李宇豪 李婧瑜 黄宁

（四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，四川 成都 610041）

许多信号，例如内毒素、细胞因子等，与细胞膜上的受体结合后，在细胞内产生一系列信号转导，最终会转入核内诱导相应靶基因表达，从而表现出相应的生物学效应，如巨噬细胞的极化等。真核细胞中，由于细胞质和细胞核被细胞核双层核模系统隔开[1]，信号分子跨核膜转运对细胞功能的发挥至关重要[2]。核转位通路的基本结构主要有三个：一是具有“分子筛”功能的核孔蛋白复合体（Nuclear pore complex, NPC），在NPC上存在靶蛋白与核转位受体的结合位点[3]；二是核转运受体；三是核转运信号[4]。信号转导和转录激活因子(STAT)是细胞外配体反应性转录因子，在胞质中被Janus激酶磷酸化、形成二聚体，然后跨过核膜转运到细胞核作用于靶基因，介导巨噬细胞极化等多种生物学过程[5-6]。因此，检测STAT这一类核转位分子的胞质、胞核的分布，对研究相关信号通路及细胞活动等十分重要。

研究核转位蛋白的核质分布变化常采用核质蛋白分离-WB的方法。其中核质蛋白分离常用的方法是两步裂解离心法，即先用破膜离心分离胞质蛋白（上清）和细胞核（沉淀），再次裂解细胞核得到核蛋白[7]。然而不同细胞的实验条件不尽相同，现有的分离条件对巨噬细胞核质分离效果不佳，这对开展核转位分子如STAT6的信号通路的相关研究造成一定限制。因此，本研究采用不同裂解液、裂解时间及离心条件，探究巨噬细胞系RAW264.7的核质蛋白分离的最佳条件。同时，选取STAT6作为核转位信号分子的具体对象，验证优化后的核质蛋白分离条件是否可以成为研究核转位分子的适用条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养

小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自上海中科院细胞中心，培养在含10%(v /v )灭活胎牛血清和抗生素的DMEM培养基中，培养条件为温度37 ℃，二氧化碳浓度5 %。

1.1.2 试剂

核质分离试剂盒（Solarbio公司，产品编号为R0050）；RLN裂解液的主要成分为50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）、140 mmol·L-1NaCl、0.5% Nonidet P-40（1.06 g·mL-1）和1.5 mmol·L-1MgCl2。RIPA裂解液的主要成分为50 mmol·L-1Tris-HCI（pH 7.4）、150mmol·L-1NaCl、1% Triton X-100、1% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS和1 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH，胞质蛋白内参）抗体（产品货号#5174S）、抗组蛋白3（Histone 3，H3，核蛋白内参）抗体（产品货号#4499S）、抗STAT6抗体（产品货号#53975）购自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 胞质蛋白的提取

取出正常培养的RAW264.7细胞，吸去残留培养基后，加入预冷PBS清洗1-2次，再加入2-3 mL预冷的PBS，将细胞吹打成单细胞悬液后，每50万个细胞为一份，500 g离心5 min去上清，加入200 μL RLN裂解液或试剂盒的浆蛋白抽提试剂（均提前加入PMSF和蛋白酶抑制剂（Protein inhibitor，PI），将细胞悬液置于冰上裂解。裂解时间包括0、1、2、3、5、10 min；而后在4 ℃进行离心，离心力为6000或12000 g，离心时间包括3、5、10 min。收集上清为胞质蛋白，存于-80 ℃待检测。

1.2.2 胞核蛋白的提取

将1.2.1中得到的细胞核用预冷的PBS洗涤两次，每次6000 g离心10 min，弃上清。然后在管中加入200 μL RIPA裂解液（含PMSF和PI），然后进行超声破碎，每次超声破碎5 s，间歇5 s，共三次，溶液均质化后，4 ℃，12000 g离心20 min，取上清即为核蛋白，存于-80℃待检测。

1.2.3 WB检测

将上述提取的胞质蛋白和胞核蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（细胞核蛋白上样量为5 μL，细胞质蛋白上样量为10 μL）后转移到硝酸纤维素膜上，脱脂牛奶封闭后，以细胞质蛋白GAPDH和核蛋白H3抗体为一抗，以相应来源二抗进行Western Blot检测。

采用核质分离的最佳条件，按照上述步骤分离RAW264.7细胞的胞质、胞核蛋白，利用STAT6抗体进行WB检测。

2 结果

2.1 分离条件初探

首先我们采用目前流行的条件（即试剂盒说明书条件）分离核质蛋白，结果发现自制RLN裂解液和试剂盒的浆蛋白抽提试剂处理后，胞核蛋白H3在分离的胞质组分中大量存在，没有达到核质分离的效果，且不同裂解时间（5或10 min）之间没有明显差异（图1A）；这说明目前采用的裂解时间过长。

接下来，我们检测裂解0 min时的分离效果，如图1B所示，两种裂解液处理后，不论离心时间长短，胞核组分中检测到大量H3，但胞质组分中仍然有较明显的H3条带；这说明分离条件有待继续优化。

图1 不同裂解时间、离心条件下，初探胞质/胞核分离效果。

2.2 裂解1-3 min的分离效果

接着，我们检测了裂解1、2、3 min时的分离效果。如图2和图3所示，裂解1 min和2 min时，自制裂解液组中，不论离心时间长短，核组分（N）中能检测到大量H3，但胞质组分中仍能检测到少量H3；在试剂盒试剂组中，各个离心条件的胞质组分的H3（C-H3）条带都很弱，甚至检测不到，且随着离心时间的增加，C-H3条带越弱。如图4所示，裂解3 min时，自制裂解液组的CH3条带非常微弱，甚至不可见；相反，试剂盒组的C-H3条带却比图2和图3中明显一些。

图2 裂解1min时，不同离心条件下胞质/胞核分离效果。

图3 裂解2 min时，不同离心条件下胞质/胞核分离效果。

图4 裂解3 min时，不同离心条件下胞质/胞核分离效果。

这些结果表明，对自制裂解液RLN来说，最佳分离条件是裂解3 min，离心力6000 g，10 min；

对试剂盒来说，最佳分离条件是裂解1-2 min，离 心力6000-12000 g，10 min。

2.3 STAT6的核质分布

有文献表明，STAT6在静息状态下主要存在于巨噬细胞的胞质中［8］。因此，我们用试剂盒试剂，按照上述最优的条件，即裂解1或2 min，离心力6000或12000g，10 min的条件分离RAW264.7细胞的核质，对STAT6在巨噬细胞核质中的分布情况进行验证。如图5所示，每个条件下C-H3条带都很弱，且以裂解1 min效果更佳；此时，胞质组分能检测到大量STAT6，而胞核组分中仅检测到少量STAT6。

图5 最优分离条件下STAT6蛋白核质表达检测

3 讨论

细胞信号转导的调控在分子细胞生物学领域一直是研究的热点。许多蛋白由胞浆进入细胞核的入核转运或逆向转运，是整个信号途径传递的一个非常重要的调控点［9］。采用WB法检测蛋白在细胞核和细胞质中的差异性表达有助于研究该分子进行核转位的情况。因此，核质蛋白分离是研究信号转导中的转录表达以及核转位现象的重要实验方法。然而，目前查阅到的核质蛋白分离策略并没有提供有效的分离细胞核蛋白和细胞质蛋白的方案，并不能很好地运用该研究方法。

我们设置了裂解液、裂解时间、离心力、离心时间的不同变量进行研究发现，在这些因素中，裂解时间和离心时间是影响核质蛋白分离效果最显著的因素，对巨噬细胞而言，最优的条件是裂解1-3 min，离心10 min。裂解液的类型对分离效果影响较小，不过需注意不同的裂解液最佳的裂解时间有所差异。而在离心力高于一定程度（>6000 g）时，对分离效果的影响较小。在此实验条件的基础上，我们对STAT6在巨噬细胞质核分布进行了检测，结果与他人的研究一致；这表明我们得出的分离核质蛋白条件能有利于高效的进行跨核信号转导的研究。

除了核质分离-WB外，还可以采用免疫荧光检测蛋白核质分布。免疫荧光利用荧光标记的抗体来检测特定的靶抗原，原位标记目的蛋白［10］。虽然它能显示单个细胞中目的分子的核质分布情况，但其具有荧光易淬灭、高背景及难准确定量等缺点。与免疫荧光法相比，核质分离-WB具有操作步骤较少、试剂设备要求较低、定量简单等优点。因此我们的研究为简单方便的跨核分子研究提供了有力支持。

综上所述，对于巨噬细胞来说，采用浆蛋白裂解液在冰上裂解1-3 min，6000 g以上离心10 min一般能达到较为理想核浆蛋白分离效果，为进一步的核转位分子的研究打下良好基础。