循环肿瘤细胞计数评估高龄中晚期非小细胞肺癌患者预后的价值分析

赵莹 李英姿 丁惠卿 吕克 张贺 孔悦

作者单位：徐州市中医院呼吸内科，江苏 徐州 221009

国家癌症中心发布的数据显示，2014年我国肺癌新发病例78.1 万，位居全国癌症发病首位，其中老年肺癌患者（>60 岁）占75.3%，大于80 岁的患者占14.2%[1]。2006～2011年癌症统计数据显示肺癌在60～74 岁人群中的发病率最高（231.8/10 万），其次是大于75 岁（138.4/10 万），而大于75 岁的肺癌患者死亡率最高（432.4/10 万）[2]。流行病学研究提示高龄老年（≥75 岁）肺癌的发病率及死亡率均居高不下，随着中国社会老龄化进程的加快，老年肺癌的发病率还将逐年升高[1]。目前，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）的靶向治疗及免疫治疗等领域研究成果颇多，但大部分临床研究为了减少混杂因素的影响，都将高龄患者排除在外，高龄NSCLC 患者的临床数据较少，对高龄NSCLC 患者的预后研究更是鲜有报道。外周血循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）是指由实体瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞[3]，获取途径相对无创、便捷、可重复，是研究高龄老年肺癌的理想研究对象。本研究旨在通过分析高龄中晚期NSCLC 患者的临床资料，以探讨外周血CTCs 水平对中晚期高龄老年NSCLC 患者的预后价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料本研究收集2017年1月～2019年4月在我院住院治疗（肿瘤内科、胸外科、呼吸科）的高龄NSCLC 患者，均为保守治疗（不再接受手术、放化疗、靶向和免疫治疗），NSCLC 诊断标准参照中国临床肿瘤学会原发性肺癌诊疗指南（2016.V1）。入组标准为：经病理学或细胞学诊断确诊为NSCLC，年龄≥75 岁，入组时TNM 临床分期为Ⅲ或Ⅳ期。排除标准：严重的呼吸衰竭、心力衰竭及肝肾功能不全者。剔除标准：在随访过程中再次选择手术、放化疗和（或）靶向及免疫治疗等任一种积极治疗方式者。收集所有患者的临床资料，包括年龄、性别、吸烟状况、病理类型、临床分期、血清肿瘤标记物水平（CEA 和CA125）。本研究获得我院医学伦理委员会批准，入组患者均签署了知情同意书。

1.2 CTCs 检测方法真空采血管采集静脉血2ml于EDTA 抗凝管中。采用全自动循环肿瘤活细胞捕获系统（NEXTCTC，无锡纳奥生物有限公司），利用CTC 核质比大和肿瘤细胞表面带负电荷的物理特性，采用不依赖于抗体的纳米微流控芯片自动分选技术分选富集CTCs，利用免疫荧光原位杂交技术，在荧光显微镜下观察，CEP8+（有3 个或者3 个以上荧光探针点）、DAPI+、CD45-判定为CTCs，并计数。根据外周血CTCs 检出数目将NSCLC 患者分为3 组，阴性组（CTCs 计数<2 个），低负荷组（2 个≤CTCs 计数<5 个）和高负荷组（CTCs 计数≥5 个）。

1.3 观察指标主要研究指标为NSCLC 患者中位生存期（单位以月计）、1年生存率、总生存率，随访方式包括住院记录、电话随访、门诊复诊三种。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料不符合正态分布的采用中位数及四分位间距表示[M（P25，P75）]，应用非参数秩和检验进行统计；计数资料采用百分率表示，行卡方检验；应用Kaplan-Meier 法计算生存时间（中位生存期），应用Log-rank 检验单因素分析临床资料对生存时间影响，将单因素分析中对生存时间有影响的因素应用Cox 回归模型进行多因素分析。应用GraphPad Prism 8.0 绘制生存曲线，采用Log-rank 法检验生存曲线间差异。P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者一般资料比较最终纳入NSCLC 患者52 例，中位年龄78.5 岁，男38 例，女14 例。CTCs阴性组20 例，低负荷组19 例，高负荷组13 例。三组患者间性别、年龄及吸烟情况差异无统计学意义（P>0.05）。高负荷组病理类型中腺癌多见（P<0.05），低负荷组及高负荷组TNM 临床分期更高（P<0.05）。阴性组与高负荷组相比， CA125 水平差异有统计学意义（P<0.05），余肿瘤标记物三组间两两比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 三组患者临床基线资料比较

2.2 影响生存时间的单因素分析将年龄、性别、吸烟、病理类型、TNM 分期、血清CEA 水平、血清CA125 水平及外周血CTCs 水平纳入生存时间单因素分析，结果显示年龄、TNM 分期、血清CA125 水平及CTCs 水平影响老年中晚期NSCLC 患者的生存时间（P<0.05），见表2。而性别、吸烟、病理分型以及血清CEA 水平对老年中晚期NSCLC 患者的生存时间影响无统计学意义（P>0.05）。

表2 影响高龄中晚期NSCLC 生存时间的单因素分析

2.3 影响生存时间的多因素分析多因素分析应用Cox 回归模型将单因素分析中有统计学意义的年龄、TNM 分期、血清CA125 水平及CTCs 水平作为自变量进行赋值，年龄:<80 岁=0；≥80 岁=1；TNM 分期：Ⅲ期=1；Ⅳ期=2;血清CA125 水平:<35U/ml=1；≥35U/ml=2；外周血CTCs 水平: 阴性组=1；低负荷组=2；高负荷组=3。结果显示,外周血CTCs 水平是影响生存时间的独立影响因素（P<0.05），比值比为1.871，见表3。

表3 影响高龄中晚期NSCLC 生存时间的多因素分析

2.4 三组NSCLC 患者的生存曲线分析三组NSCLC患者中位生存期、1年生存率、随访结束时各组总生存率见表4。生存曲线显示三组曲线明显分开，三组间差异有统计学意义（P<0.0001），见图1。

图1 三组高龄中晚期NSCLC 患者的生存曲线

表4 三组患者的中位生存时间、1年生存率和总生存率比较

3 讨论

CTCs 是实体肿瘤播散在血液中的“种子”，在血行播散、移行及定植过程中，其生物学特性受多种因子调节，包括许多信号分子（如细胞因子和趋化因子等），受调节的CTCs 表型发生变化，进而引起新的转移性病变，是肿瘤复发的主要原因[4]。外周血CTCs 水平在一定程度上反映了患者体内的肿瘤负荷情况及复发转移风险。近年来，多种恶性肿瘤的预后研究均提示CTCs 水平与肿瘤的预后具有相关性[5]。2004年Cristofanilli 等[6]首次报道了外周血中的CTCs 水平是预测转移性乳腺癌无进展生存期和总生存期的有效生物标记。有研究发现在NSCLC 术后患者的外周血中出现成簇的CTCs 提示预后较差[7]。

本研究对象为保守治疗的高龄老年中晚期NSCLC 患者，目前，文献对这类人群的预后研究较少，也没有合适的生物标记物来预测生存期。CTCs由于其侵入性小，易于获得，并且具有较好的可重复性，对老年肺癌患者来说是一种极具实用性和前景的方法学，但目前在高龄NSCLC 患者中CTCs 的研究数据较少。本研究分析了52 例高龄中晚期NSCLC 患者外周血的基线CTCs 水平，将其分为阴性组、低负荷组及高负荷组，分析临床资料与外周血CTCs 水平对这部分人群中位生存期的预测价值。结果显示在对高龄中晚期NSCLC 患者的临床资料单因素分析中，年龄≥80 岁、TNM 分期较高、血清CA125 水平≥35U/ml 以及CTCs 负荷较高提示预后不良，再进行多因素分析，结果显示外周血CTCs 水平仍是患者预后的独立影响因素。高负荷组患者的中位生存期仅为3 个月，1年生存率为0，而CTCs 阴性组中位生存期可达10 个月，1年生存率可达45.0%。

本研究分析提示CTCs 负荷较高的NSCLC 患者的临床分期更高，腺癌更多见。尽管目前外周血CTCs 水平对NSCLC 的分期指导意义尚无定论，但既往的诸多研究中提示肺癌临床分期越高，CTCs阳性率往往也越高。Chen 等[8]分别检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者外周血CTCs 水平，其阳性率分别为0、12.5%、20.0%、30.9%，结果显示外周血CTCs水平与NSCLC 的临床分期呈正相关。这提示外周血CTCs 水平可能作为肺癌临床分期的潜在生物标记。关于外周血CTCs 水平与肺癌的组织病理分型的相关性研究也尚无定论，Man 等[9]发现肺腺癌患者的外周血CTCs 阳性检出率为74.0%，高于非腺癌NSCLC 患者（48.0%），提示CTCs 在肺腺癌患者的随访及预后监测中可能更有意义。但黄祥奇等[10]发现NSCLC 患者外周血CTCs 阳性率与肿瘤的组织病理分型无明显相关性。因此，外周血CTCs 与NSLCLC 的组织病理分型相关性还需要依赖CTCs 检测手段的进步及CTCs 详细表型的检测来进一步研究确定。

本研究在高龄NSCLC 中CTCs 预后分析的研究结果与其他年龄组NSCLC 的CTCs 研究结果相似，Lindsay 等[11]对125 例NSCLC 患者（平均年龄61 岁）CTCs 计数的研究发现，与CTCs 计数<5 个的NSCLC 患者相比，CTCs 计数≥5 个的患者表现出较差的预后，总生存时间更短，中位生存期为197d。有报道应用CellSearch 和CEACAM5 mRNA分析方法研究未化疗ⅢB 和Ⅳ期NSCLC 患者（平均年龄67 岁）的CTCs 计数，结果显示作为独立的危险因素，外周血中携带≥5 个CTCs 的患者复发和死亡风险明显增高[12]。杜静怡等[13]也发现外周血基线CTCs 计数<5 个的晚期肺鳞癌患者比基线CTCs 计数≥5 个的患者无进展生存期更长，基线CTCs 计数对晚期肺鳞癌患者的预后具有预测价值。此外，外周血CTCs 水平对NSCLC 患者的治疗效果也有一定的预测意义，胡亚锋等[14]发现CTCs 水平在中晚期NSCLC 患者化疗联合分子靶向治疗过程中具有疗效评价价值。李晓华等[15]研究发现外周血CTCs 高阳性表达是老年NSCLC 患者化疗无效的独立影响因素之一。总之，外周血CTCs 的研究对于NSCLC 患者的生存预测研究具有重要意义。

续表2

本研究结果提示在保守治疗的高龄中晚期NSCLC 患者中，外周血中CTCs 的水平是其预后的独立影响因素，CTCs 高负荷患者生存期较短，外周血CTCs 水平可作为高龄中晚期NSCLC 患者的预后生物标记物。

本研究也存在一定局限性：样本量较小，代表性不强，由于实验条件的限制未对CTCs 的表型进行进一步分析。近年来，NSCLC 的CTCs 相关研究逐渐深入，可鉴定CTCs 中EGFR 或ALK 基因突变，随访新的EGFR 突变（包括T790 突变等），以及鉴定除了基因突变以外的遗传改变，包括NSCLC中的ALK/ROS1 重排，和PD-1 或PD-L1 等免疫治疗位点[16]。这些CTCs 的研究新领域对NSCLC 的治疗及药物耐药性分析都有重要意义，这也将是CTCs 研究未来的发展方向。