甲状腺乳头状癌中DPP4的表达及临床意义

陈保林，姜 焱，伍红瑜，李佳阳，杨丹莉，吕俊远，程晓明

甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势[1]。据国家癌症中心统计，2005～2015年我国甲状腺癌的发病率年均增加12.4%，病死率年均增加2.9%[2]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的甲状腺癌，PTC伴有淋巴结转移是患者术后复发的高危因素[3]。因此，发掘甲状腺癌诊断及转移风险评估的生物标志物尤为重要。二肽基肽酶4(dipeptidyl pepdidase 4, DPP4)亦称CD26，是一种细胞表面糖蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶S9家族，参与肿瘤细胞增殖、迁移、黏附、侵袭等过程，是促进肿瘤发生、发展的重要因子[4]。本实验拟探索PTC中DPP4的表达情况，分析其表达量变化与PTC临床病理特征的关系，为甲状腺癌诊断及转移风险评估寻找可靠的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)收集甲状腺癌组织及正常甲状腺组织合计849例，比较甲状腺癌与正常甲状腺组织中DPP4 mRNA的表达量变化，并分析其表达水平与甲状腺癌患者预后的关系。另选取2018年1～12月遵义医科大学附属医院存档的73例甲状腺标本：共纳入PTC石蜡标本54例，其中伴淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者23例；癌旁正常石蜡标本19例。男性16例，女性57例，平均年龄(44.2±12.7)岁。所有患者均为首次行甲状腺手术，术后病理证实为PTC。本实验通过遵义医科大学附属医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1GEPIA数据分析 在GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)中检索并分析DPP4 mRNA在甲状腺癌及正常甲状腺中的表达情况，以中位数为分隔界值将甲状腺癌组织中DPP4表达量分为低表达和高表达，以疾病复发为终点事件绘制Kaplan-Meier曲线，分析DPP4表达量与患者预后的关系。

1.2.2免疫组化 免疫组化染色采用SP法，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。兔抗人DPP4抗体购自美国Abcam公司(ab187048)，SP检测试剂盒购自索莱宝生物公司(SP0041)。DPP4阳性定位于细胞膜和细胞质，显色呈淡黄色至棕褐色。免疫组化结果判读由两位病理科医师在双盲情况下随机选取5个至少含有100个细胞的高倍镜(400×)视野，观察阳性细胞百分数及染色强度。(1)染色强度：无阳性显色或细胞显色与周围间质无法区分者为0分；浅黄色为1分；黄色或棕黄色为2分；棕褐色为3分；(2)阳性细胞百分数：阳性细胞数<5%为0分；5%～25%为1分；26%～75%为2分；>75%为3分。将上述两项得分结果相乘为最终判读：0分为阴性，≥1分为阳性，1～3分为低表达，4～6分为中表达，≥7分为高表达。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料采用百分数(%)表示，采用χ2检验比较DPP4在PTC和癌旁组织中的表达差异，分析其表达水平与PTC临床病理特征的关系，Kaplan-Meier法分析DPP4表达量与患者预后情况。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺癌中DPP4的表达GEPIA数据库收集了512例甲状腺癌组织及337例正常甲状腺组织DPP4 mRNA的表达情况，在正常甲状腺组织中DPP4 mRNA呈低表达，在甲状腺癌组织中其表达量显著升高，组间差异有统计学意义(P<0.01，图1)。为进一步验证DPP4在PTC中的表达量变化，本实验采用免疫组化法检测PTC及癌旁正常甲状腺组织中DPP4蛋白表达，结果提示PTC组织中DPP4阳性率为87.0%(47/54)，癌旁正常甲状腺组织中均未见DPP4表达(0/19)，组间差异有统计学意义(P<0.05，表1，图2)。

表1 PTC及癌旁正常甲状腺组织中DPP4的表达

2.2 DPP4表达与PTC临床病理特征的关系DPP4表达水平根据患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移情况、AJCC分期等因素进行亚组分析。结果显示，DPP4表达与淋巴结转移密切相关，有淋巴结转移者阳性率显著上升(χ2=6.116，P=0.013)；而与患者性别、年龄、肿瘤直径、AJCC分期均无关(P>0.05，表2)。

表2 PTC中DPP4表达与临床病理特征的关系

2.3 DPP4表达对甲状腺癌患者预后的影响淋巴结转移是甲状腺癌术后复发的重要因素，因此应用GEPIA数据库分析DPP4表达量与甲状腺癌患者无瘤生存期(disease-free survival, DFS)的关系，结果提示DPP4 mRNA高表达组较低表达组患者的DFS显著缩短(图3)，高表达组甲状腺癌的复发风险为低表达组的1.8倍(HR=1.8，P=0.048)。

图3 DPP4 mRNA表达与甲状腺癌DFS的关系

3 讨论

国内外指南均提出PTC的治疗应以降低复发率、提高患者DFS为目标[5-7]。因此，精准评估甲状腺肿瘤的恶性程度具有重要意义。DPP4能够与多种底物和蛋白分子相互作用，使得其与肿瘤的发生过程密切相关[4]。在PTC细胞系GLAG-66和TPC-1中沉默DPP4可抑制MAPK通路，进而抑制肿瘤细胞增殖及上皮-间质转化[8]；反之，促进DPP4转录可激活p62/Nrf2/Keap1通路，诱导PTC细胞增殖、迁移[9]。上述研究表明，DPP4是参与PTC发生、发展的关键因子，而本实验进一步证实DPP4在PTC组织中高表达，提示DPP4可作为诊断PTC的生物标志物。

此外，本实验发现DPP4表达与PTC淋巴结转移密切相关，且DPP4高表达者DFS缩短、复发风险增高。研究证实淋巴结转移是术后复发的重要危险因素，N1a患者术后复发HR为2.28～3.80，而N1b患者术后复发HR高达12.24～12.26[3,10]。上述研究提示，通过检测DPP4在癌组织中的表达水平，有助于判断PTC患者术后复发风险。

综上所述，如何判断PTC的复发风险是诊治该疾病的关键议题。本实验提示，DPP4在PTC中高表达，且与淋巴结转移及术后复发密切相关，可作为PTC诊断及预后判断的生物标志物。目前DPP4在甲状腺癌领域的研究多为回顾性、小样本实验，尚需设计包含甲状腺细针穿刺物、甲状腺肿瘤组织样本、血清等多种样本及多种病理亚型的前瞻性、大样本实验；同时，应纳入BRAF、RAS、TERT等甲状腺癌易感基因突变状态进行亚组分析，深入研究DPP4在PTC中的作用方式与分子机制，以“分子分型”的研究视角剖析DPP4与PTC临床病理特征的关系，夯实DPP4在PTC诊断、预后评估、术后监测中的临床应用价值。