罕见AB型类孟买血型的鉴定*

林 霞 杨晓俊 陈贵玲 张云霞 林海斌 谢海花

1 福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院输血科，福建省福州市 350001； 2 福建医科大学附属第一医院； 3 福建省立金山医院

类孟买血型是一类稀有的红细胞血型。类孟买血型的特征是红细胞可能与抗-A和(或)抗-B发生弱反应或不反应，与抗-H不发生反应，血清中含有天然IgM型抗-H(I)，因此极易将类孟买人群的ABO血型误定型为O型。本文通过3例罕见的AB型类孟买血型的鉴定，深入探讨类孟买血型的血清学与分子生物学特征。

1 对象和方法

1.1 研究对象 患者1：肺肿物患者，女，66岁；患者2：乳腺癌患者，女，52岁；患者3：妊娠状态，女，29岁。在3例患者血液标本进行血型鉴定时发现正定型O型，反定型AB型，正反定结果不一致,故各自采集EDTA-K2抗凝全血与唾液标本进行进一步血清学和分子生物学检测。

1.2 主要试剂与仪器 Erytra全自动血型分析仪、DG Gel ABO-CDE 卡、0.8%反定型 A1/B细胞 、抗人球蛋白卡、抗筛细胞(西班牙戴安娜公司)；单克隆抗-A、抗-B、抗-H、A1/B/O型标准红细胞(上海血液生物医药有限公司)；人源抗-A和抗-B(自制,抗体效价>128,不含不规则抗体和冷凝集素)；基因组DNA提取试剂盒和人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血型血清学试验。严格按照《全国临床检验操作规程》[1]和相应试剂使用说明书进行ABO血型鉴定(微柱法与试管法)、吸收放散试验、唾液ABH 血型物质检测、不规则抗体筛查。

1.3.2 糖基转移酶活性测定[2]。(1)随机挑选3人份O型献血员红细胞混合，用生理盐水洗涤3次后，取压积红细胞40μl，加入400μl反应液中[0.05mol/L 咪唑缓冲液(pH=6.5)、25mmol/L MnCl2、0.15mol/L NaCl、0.5%(质量浓度)牛血清白蛋白各40μl；0.5mmol/L UDP-GalNAc 40μl(检测A酶活性用)或0.5mmol/L UDP-Gal 40μl(检测B酶活性用)；待检血浆200μl]；37℃水浴4h(期间不时摇晃)后，再用生理盐水洗涤3次，制得5%指示红细胞悬液待用。(2)将单克隆抗-A和抗-B进行倍比稀释(1∶1～ 1∶128)后待用。(3)取50μl 5%指示红细胞悬液，与50μl不同稀释度的抗-A、抗-B混合后，置室温反应20min，1 000r/min 离心30s，观察凝集强度。血浆酶活性强度以发生凝集的抗体最高滴度来表示，并随机选取A型、B型和O型各3人份献血员的混合血浆作为阳性和阴性对照。

1.3.3 ABO基因分型。严格按照试剂说明书的操作流程提取样本基因组DNA，采用ABO基因分型试剂盒(PCR-SSP法)进行ABO基因分型。

1.3.4 FUT1基因直接测序。根据 FUT1基因参考序列(GenBank Accession Number NM-000148.4)设计FUT1 CDS区引物，正向测序引物为5’-GTCTAAACCTTTAACTTCCTCTT-3’，反向测序引物为5’-AAGATCAGGCTACTTCAGAA-3’，产物为1 270bp。引物合成、PCR扩增、直接测序均由福州尚亚生物技术有限公司协助完成。测序结果使用Chromas软件进行序列比对分析。

2 结果

2.1 血型血清学试验结果 3例患者正定型O型，与抗-H无凝集。反定型AB型，与O细胞弱凝集，血浆中存在37℃无活性抗-H(I)。唾液中检出A、B、H物质。患者3的吸收放散试验结果显示其红细胞表面存在弱A、B抗原。结果详见表1。3例患者卡式抗人球蛋白法不规则抗体筛查阴性。3例患者血清学表型均为ABmh。

表1 血型血清学鉴定结果

2.2 糖基转移酶活性测定结果 3例患者和AB型阳性对照组血浆均能在体外合成A抗原和B抗原，A酶和B酶活性均在1∶64～1∶128。

2.3 ABO基因分型(PCR-SSP法)结果 3例患者ABO基因PCR-SSP分型结果为AB型，见图1。

图1 3例患者的ABO基因PCR-SSP结果

2.4 FUT1基因直接测序结果 患者1和患者3的FUT1基因测序结果为h1h1型(551-552delAG的纯合突变)，见图2；患者2的FUT1基因测序结果为h1h2型(551-552delAG和881-882delTT的杂合突变)，见图3。

图2 患者1和患者3的FUT1基因直接测序结果

图3 患者2的FUT1基因直接测序结果图

3 讨论

根据ISBT官网最新更新，目前人类一共发现39个血型系统，H血型系统是第18个血型系统。H血型系统只有一个H抗原，H抗原是ABO血型系统的前体物质，受控于19号染色体上两个紧密连锁的基因位点：FUT1(H)基因和FUT2(Se)基因。FUT1基因编码α1,2-L-岩藻糖基转移酶催化GDP-L-半乳糖上的岩藻糖基连接到前体分子末端半乳糖基的 C-2 位上，生成脂溶性H抗原，主要存在在人类红细胞等细胞膜上，FUT2基因编码α1,2-L-岩藻糖基转移酶催化1型前体生成可溶性H抗原，主要存在于体液、分泌液中[3]。孟买血型的FUT1基因型为hh，FUT2基因型为sese，故孟买血型红细胞和分泌物中均缺乏H抗原；而类孟买血型的FUT1基因型为hh，FUT2基因型为 Se/Se 或 Se/se，因此类孟买血型只表现为红细胞表面部分或完全缺失H抗原，其分泌液中有H物质存在。目前，在我国尚未有孟买血型的出现，都是类孟买血型的报道。本文的3例患者均因正定型O型，反定型AB型，正反定结果不符进一步检测发现其红细胞与抗-H试剂不凝集，证实红细胞表面几乎无H抗原。血浆中存在IgM型抗-H(I)。对患者3进行吸收放散实验，证实红细胞表面弱A、B抗原的存在。在3例患者唾液中也检测出A、B、H物质。3例患者血浆均能在体外合成A抗原和B抗原，说明血浆中存在正常活性的A糖基转移酶和B糖基转移酶，但因患者FUT1基因突变无法合成H抗原，所以体内红细胞表面无法表达A,B抗原。从以上血清学实验均可证实患者ABO血型为AB型。

我国目前已报道的类孟买血型分布频率，台湾为1/8 000，福建为1/8 500，香港为1 /15 620，北京为1/102万[4-5]，多分布于我国东南沿海地区。AB型类孟买的报道更为少见[6]。在中国人群中最常见的FUT1基因的突变类型是h1(551-552delAG)、h2(881-882delTT)、h3(658C>T)。2006年有文献报道[4]福建地区人群发现的14例类孟买个体的FUT1基因分析，其中h1基因占67.85%，h2基因占25%，本次研究发现的3例类孟买血型，经FUT1基因直接测序结果显示2例患者为h1h1型突变，1例患者为h1h2型突变，笔者的结果与上述研究成果大体相近。根据ISBT官网提供的Names for H (ISBT 018) blood group alleles v5.1 170221数据显示，截至目前已发现56种FUT1基因突变类型，按照基因结构改变的类型分类可分为碱基置换51种、碱基缺失4种和碱基插入1种。在35种H抗原弱表达型FUT1基因突变中，33种为碱基置换(在我国发现报道过的c.235A>G[7]、c.293C>T[7]、c.328G>A[8]、c.424C>T[9]、c.649G>T[10]、c.658C>T[8]、c.661C>T[11]、c.682A>G[7])。由于FUT1基因某一位点发生核苷酸替换，造成相应的编码的氨基酸的替换，被替换的氨基酸可能是α1,2-L-岩藻糖基转移酶酶活性中心的重要组成部分，因此导致酶活性不同程度减低，H抗原部分缺失，正定时可与抗-A和(或)抗-B出现±～3+强度的凝集，但与抗-H不凝集。在21种H抗原完全缺失型突变中，3种为碱基缺失，如本文报道的h1型和h2型。由于碱基缺失，导致阅读框架发生移码，在氨基酸翻译过程中提前出现终止密码子，形成截短的α1,2-L-岩藻糖基转移酶，使酶活性大大减低，H抗原大量缺失，红细胞上往往只表达微量的A或B抗原，常规血清学检测中不能与单克隆抗-A或抗-B发生凝集，正定型表现为O型，其红细胞表面的弱A、B抗原只能通过吸收放散实验来证实。这些基因突变对α1,2-L-岩藻糖基转移酶活性的影响需通过对FUT1基因的转染表达后方可证实。FUT1和FUT2两个基因位于19号染色体长臂上,相距仅35kb，具有70%的同源性[3]。FUT2基因的多态性呈现明显的地域性和种族性的特点，在池泉等[4]研究中发现，福建地区h1 基因与Se357基因连锁, h2基因与Se357,716基因连锁,存在着h1-Se357和h2-Se357,716的单元型。本文所述的3例患者的FUT1与FUT2基因的连锁关系有待进一步研究。

由于类孟买患者血浆中可能存在高效价的高频抗体抗-H(I)，所以在正常献血者中找到与患者配血相合的血液的可能性微乎其微。当类孟买患者需要输血治疗时，建议从患者家属中寻找同是类孟买血型的家属，或者联系当地的血液中心寻找。紧急情况下，选择与患者配血主侧凝集强度最弱的ABO同型的血制品，37℃保温慢输，严密监控。