Src在舌鳞状细胞癌组织中的表达及对舌鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用

李军 陈伟程 徐若竹 汤佳臻

深圳市龙岗区人民医院口腔科（广东深圳518100）

口腔癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）为头颈部最常见的恶性肿瘤［1⁃2］，5年生存率约为63%，其中舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell car⁃cinoma，TSCC）最为常见。由于舌部运动以及淋巴回流原因，TSCC 淋巴结转移率较高［3⁃4］，从而降低患者的生存率。尽管TSCC的治疗已经取得了最新进展，但TSCC 的病死率仍然很高［5⁃6］。所以有必要对TSCC 进展涉及的分子途径进行研究，为TSCC新的治疗策略提供方向。

Src 酪氨酸激酶（Src tyrosine kinase，Src）是一种非受体酪氨酸激酶，分子量为60 kDa。Src 作为Src 激酶家族的成员，在细胞增殖、侵袭和迁移等方面发挥重要作用［7⁃9］。研究表明，Src蛋白在多种肿瘤细胞中高度活化，并促进肿瘤的发生发展［10⁃11］。但Src 蛋白在舌鳞癌中的作用尚未明确，本研究将对Src 蛋白在口腔舌鳞癌中的表达和与临床病理特征之间的关系以及对舌鳞癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料来源收集2012年2月至2019年2月于我院口腔颌面外科就诊的TSCC 患者20 例，其中男12 例，女8 例，年龄33～60 岁。所有病例术前病理活检均确诊为TSCC，术前未行放疗或化疗。切取TSCC 组织和肿瘤边界外约1 cm 的癌旁组织进行研究。该研究通过医院伦理委员会批准，纳入研究的患者本人或其家属均知情同意。

1.2 主要试剂兔抗人Src 单克隆抗体（Cell Sig⁃naling Technology，美国）；即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒、加强型DAB 显色试剂盒、中性树胶（福州迈新生物股份有限公司，中国），EDTA组织抗原修复液（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；舌鳞癌SCC127 细胞系购自ATCC，DMEM 及胎牛血清（Gibco，美国），基底膜基质BD Matrixgel（354234）（Thermo Fisher，美 国），SRC 的shRNA 载体合成自上海吉玛制药技术有限公司，SRC⁃shRNA 1#：AAACTCCCCTTGCTCATGTACTT，SRC⁃shRNA 2#：CATCCTCAGGAACCAACAATTC；CCK⁃8 试剂盒（Dojindo，日本）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化采用S⁃P 法：（1）10%甲醛溶液固定标本，脱水，石蜡包埋后4 μm 连续切片；（2）65 ℃烤片，2 h，经二甲苯及梯度酒精脱蜡、水化；（3）pH=9.0 的EDTA 组织抗原修复液，高压修复10 min 后自然冷却。PBS 洗涤3 次后3%过氧化氢室温处理10 min，PBS 洗涤3 次，山羊血清封闭30 min 后加入兔抗人Src 单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；（4）PBS 洗涤3 次，加入二抗室温下作用30 min，PBS 洗涤3 次；（5）滴加DAB 显色液，通过显微镜控制反应时间，PBS 终止染色后苏木素复染，自来水冲洗，PBS 返蓝；（6）切片经酒精及二甲苯透明、干燥，中性树脂封片。

选取高倍镜视野，参照YOSHIKAWA 法［12］判定结果：（1）两名病理科专家在不知其临床病理特征下，显微镜下观察细胞数。（2）将包膜呈黄或棕黄色细胞视为阳性。（3）根据肿瘤细胞染色百分比进行分级：无阳性反应或阳性染色＜5%为（-），≥5%且＜35%为（+），≥35%且＜65%为（++），≥65%为（+++）。

1.3.2 细胞培养TSCC细胞系SCC127用含有10%胎牛血清和100 μg/mL 青霉素的DMEM 培养基培养细胞，培养条件为37 ℃，5%CO2。

1.3.3 细胞转染取对数期舌鳞癌细胞系SCC127，将细胞接种到6 孔板，待细胞贴壁后更换为不含血清和青霉素的DMEM 培养基，培养6 h 后，将SRC⁃shRNA 转染SCC127 细胞系，继续培养72 h 后，收集细胞用于后续检验。

1.3.4 实时荧光定量PCR收集转染72 h 后的SCC127 细胞，采用TRIzol 试剂提取总RNA。取RNA 使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，然后将cDNA 作为RT⁃qPCR 的模板，在反应体系中加入TaqDNA 聚合酶及引物进行分析。SRC 上游引物为5′⁃CAGTGTCTGACTTCGACAACGC⁃3′，下游引物为5′⁃CCATCGGCGTGTTTGGAGTA⁃3′；GAPDH 上游引物序列为5′⁃GAAGGTGAAGGTCGGAGTC⁃3′，下游引物序列为5′⁃GAAGATGGTGATGGGATTTC⁃3′；采用2⁃ΔΔCt法进行量化分析。

1.3.5 蛋白质印迹法分别取已转染SRC⁃shRNA和对照NC⁃shRNA SCC127 细胞，利用RIPA 裂解后，离心提取总蛋白后用BCA法进行蛋白定量。在10%SDS⁃PAGE 凝胶上分离出30 μg 总蛋白，电泳结束后转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入Src 一抗（1∶500 稀释），4 ℃条件下孵育过夜。第2 天洗膜后，室温条件下用HRP 标记的山羊抗兔IgG 孵育1 h，PBST 洗膜后加入显影液曝光显像。SRC 条带灰度值反映蛋白的相对表达水平。

1.3.6 细胞增殖实验利用CCK⁃8 法评估细胞增殖。取已转染SRC⁃shRNA（实验组）和NC⁃shRNA（对照组）的SCC127 细胞，以5×103细胞/孔的数量接种到96 孔板中，分别培养24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK⁃8 试剂，37 ℃条件下孵育2.5 h 后，用酶标仪测量在450 nm 波长下的光密度值（OD）。

1.3.7 Transwell 侵袭实验取已转染SRC⁃shRNA（实验组）和NC⁃shRNA（对照组）的SCC127 细胞，胰酶消化后离心收集细胞，无血清培养基重悬混匀，调整细胞密度为2.5 × 105个/mL，接种于小室上室，200 μL/孔。待细胞贴壁稳定后，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h。轻柔擦弃上室细胞与基质胶，经4%多聚甲醛固定5 min，0.01%结晶紫染色后，双蒸水漂洗后晾干。随机选取5 个400 倍视野拍照，计算各组中穿膜细胞数量。

1.3.8 划痕实验取已转染SRC⁃shRNA（实验组）和NC⁃shRNA（对照组）的SCC127 细胞，胰酶消化后计数，将细胞接种于6 孔板（接种数量以次日铺满6 孔板一层为宜）。培养24 h 后，在6 孔板中用200 μL 枪头呈“一”字划痕，生理盐水冲洗3 次，更换含血清的DMEM 培养基，划痕后24 h 观察细胞的迁移情况并拍照记录，重复实验3 次。

1.4 统计学方法用SPSS 25.0 进行统计学分析，采用GraphPad prism 7.0 作图软件（Version X，USA）作图,利用Image J 图像分析软件统计Transwell 细胞个数。计量资料用均数±标准差表示，比较方法采用t检验，多组比较采用方差分析；计数资料用例（%）表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Src 蛋白在TSCC 组织、癌旁组织的表达Src 蛋白在TSCC 及癌旁组织中均有表达，癌旁组织阳性率为15%（3/20），癌组织阳性率为75%（15/20）。中强阳性率：癌旁组织为0（0/20），癌组织为60%（12/20），差异有统计学意义（P<0.001）。见表1、图1。

表1 Src 蛋白在舌鳞癌组织及癌旁组织的表达Tab.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues例

图1 Src 在TSCC 及癌旁组织的表达Fig.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues

2.2 TSCC 中Src 蛋白的表达与临床及病理特征之间的关系不同年龄、性别和肿瘤分化程度患者Src 蛋白表达差异无统计学意义（P> 0.05）。临床分期Ⅰ、Ⅱ期患者Src 阳性表达率显著低于Ⅲ和Ⅳ期（P<0.05）；中高分化显著低于低分化（P<0.05），T1和T2分期显著低于T3和T4分期（P<0.001）；淋巴转移者显著高于无转移者（P<0.05）。见表2。

表2 TSCC 组织中Src 表达与临床及病理因素之间的关系Tab.2 Relationship between Src expression and clinical and pathological factors in tongue squamous cell carcinoma

2.3 shRNA 序列对SRC 表达的影响SRC shR⁃NA⁃1#和SRC shRNA⁃2#均可抑制SRC 的表达，且SRC shRNA⁃2#的效果优于SRC shRNA⁃1#，见图2。故本研究主要用SRC shRNA⁃2#来进行功能研究。

图2 Western Blot 和定量PCR 检测SRC⁃shRNA 对SRC 表达的影响Fig.2 Effect of SRC⁃shRNA on Expression of SRC by Western Blot and Quantitative PCR

2.4 沉默SRC 抑制舌鳞癌细胞系SCC127 细胞的增殖能力将SRC⁃shRNA 转染至舌鳞癌细胞系SCC127 后，利用CCK⁃8 法检测沉默SRC 对细胞增殖的影响。结果显示，沉默SRC 表达可显著减低SCC127 细胞的增殖，见图3。

图3 利用CCK⁃8 法检测SRC⁃shRNA 对SCC127 细胞增殖的影响Fig.3 Effect of SRC⁃shRNA on proliferation of SCC127 cells by CCK⁃8 assay

2.5 沉默SRC 抑制TSCC 细胞系SCC127 细胞的侵袭能力Transwell 侵袭实验结果显示，与NC⁃shRNA 组相比，SRC⁃shRNA 组穿过基底膜的细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P< 0.05），结果表明Src 能够抑制TSCC SCC127 细胞的侵袭能力。见图4。

图4 Transwell 侵袭实验检测对照组与实验组TSCC SSC127 细胞的侵袭能力Fig.4 Transwell invasion assay was used to detect the invasion ability of human tongue carcinoma SSC127 cells in the control and the experimental groups

2.6 沉默SRC抑制TSCC细胞系SCC127细胞的迁移能力划痕实验检测结果显示，24 h SRC⁃shRNA组迁移率为（60.93±1.27）%，NC⁃shRNA组为（77.40± 2.24）%，两组间差异有统计学意义（P< 0.001），提示沉默SRC 能够抑制人TSCC 细胞系细胞的迁移能力。见图5。

图5 划痕实验检测对照组与实验组TSCC SSC127 细胞迁移能力Fig.5 Detection of migration ability of human tongue cancer SSC127 cells in control and experimental groups by scratch test

3 讨论

TSCC 是口腔颌面部常见的恶性肿瘤,其生物学特征主要表现为局部浸润生长以及颈部淋巴结转移。TSCC 的发生发展是一个多因素、多基因参与、多步骤的复杂过程，通过合理检测肿瘤标志物有助于TSCC 的早期诊断和预后监测，然而单一肿瘤标志物具有局限性，应用多种标志物联合检测以增加其敏感性和特异性，对TSCC 患者颈部淋巴结转移进行监测，具有较高的社会效益［13］。

Src 作为Src 家族蛋白酪氨酸激酶（Src family protein tyrosine kinases，SFKs）的核心成员，在有丝分裂、细胞生长和肿瘤发生等方面发挥了重要作用［14-16］。先前研究表明，Src 在维持细胞侵袭性表型而非细胞周期进程中起作用［17］。在肿瘤细胞的转移过程中，Src 可以与整合素（Integrin）家族的不同亚型作用，从而影响细胞的运动和转移［18］。Integrins 为α和β亚单位非共价结合形成的一种跨膜二聚体受体。上调integrin α和β可增加癌细胞的侵袭和转移［19-20］。Intergrins 介导的细胞黏附作用能够诱导FAK 产生自磷酸化，从而产生可与Src的SH2 区结合的位点，FAK 与SH2 形成同步化黏着斑FA 连接，这是调节细胞运动的关键结构［21］。活化的FAK⁃Src复合可通过聚集并磷酸化p130CAS蛋白激活Rac1 活性来促进膜突出的形成［22］。此外，Src 的SH3 区还可与intgerin⁃β3 直接作用，募集并磷酸化Syk，激活Rac1，刺激板状伪足形成及细胞扩散［23-24］。已有文献报道多种人肿瘤都有较高水平的Src 蛋白表达，如乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌［19，25-26］。HERMIDA⁃PRADO 等［27］研究发现Src 表达与喉癌疾病进展、淋巴结转移及肿瘤复发呈正相关，这些都证明了Src 在癌症发生发展中的作用。已有多种Src 抑制剂被批准应用于治疗多种恶性肿瘤，如博舒替尼、达沙替尼、帕纳替尼、塞卡替尼等。其中塞卡替尼在复发和转移头颈部鳞癌的临床试验中无反应［28］，而达沙替尼联合西妥昔单抗治疗有36%转移性头颈部鳞癌患者无疾病进展［29］。

本研究结果表明Src 在口腔TSCC 组织中高表达，进一步对患者的临床病理学特征进行分析后发现，Src 蛋白的表达与患者的年龄、性别无关，但与患者的肿瘤分化程度、临床分期、T 分期、淋巴结转移相关，临床分期越晚、T 分期越晚、淋巴结转移及分化程度越低者的Src 蛋白表达率越高，提示Src 在TSCC 发展中发挥了重要作用。利用sh⁃RNA 下调SRC 的表达后，可以抑制TSCC 细胞系SCC127 的增殖，并可以抑制SCC127 的侵袭迁移能力，提示Src 可以促进TSCC 细胞的增殖和侵袭迁移。

综上所述，Src 蛋白在TSCC 中高表达，且与TSCC 患者预后不良因素相关，下调SRC 可以促进TSCC 细胞系SCC127 的增殖、侵袭和迁移能力，说明Src 蛋白在TSCC 的发展过程中起一定的作用，可为日后TSCC 临床治疗提供新的靶点。