PRKAA2基因在肿瘤细胞与血细胞中表达差异研究

孙春霞 陈书坤 郑磊

南方医科大学南方医院检验科（广州510515）

癌症已经成为全球最严重的致死性疾病之一。据全球癌症统计数据估计，2020年全球癌症发病人数和死亡人数分别达到1 930 万和1 000 万［1］。研究［2］表明转移和复发是癌症患者死亡的主要原因，血行播散则是癌症转移和复发的主要途径，因此检测循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）对癌症患者的转移和复发的预测及疗效监测具有重要的临床意义。CTCs 是由实体瘤脱落进入血液循环的肿瘤细胞，作为“液体活检”的主要标本之一，具有无创、便捷和可实时监测的特点，有助于实体瘤的早期检测与预后评估，在个体化治疗及疗效监测中具有重要临床意义［3］。然而，CTCs 数量十分稀少，从数以万计的血细胞中准确识别CTCs 成为了一项主要技术难题，极大阻碍其临床应用［4］。目前，联合多种上皮标志物及间质标志物检测已经成为提高CTCs 检出率的一个有效策略［5-6］，但该策略存在特异性不足的问题。因此，迫切需要开发特异性高的标志物，方便实体瘤外周血的CTCs 的鉴定。

本研究利用肿瘤细胞与血细胞脂质代谢水平差异的特点，使用原位锁式探针杂交技术原位检测肿瘤细胞和白细胞（WBC）的脂代谢相关基因PRKAA2 的差异表达，为PRKAA2 用于CTCs 的鉴定提供可靠的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系人肝癌细胞HepG2，宫颈癌细胞Hela，胶质瘤细胞U87 和前列腺癌细胞PC⁃3 均购自上海中科院细胞研究所细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂与仪器LightCycler 480 实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）、倒置共聚焦荧光显微镜（日本尼康公司）、细胞涂片离心机（中国上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（中国Tiangen 公司）、Fast⁃Fire qPCR PreMix（中国Tiangen 公司）、Ampligase®DNA Ligase（美国Lucigen 公司）、Rnase H，Rever⁃taid H Minus Rt Ea，Ribolock Rnase Inhibitor Ea，Phi29 DNA Polymerase Ea（美国Thermo Fisher Scien⁃tific 公司）、LymphoprepTM（加拿大Stemcell 公司）、qRT⁃PCR 引物（中国BGI 公司）、原位杂交引物和探针（中国BGI 公司）、CellTrace CFSE Cell Prolifer⁃ation，CFSE，Slowfade gold antifade reagent，2⁃（4⁃Amidinophenyl）⁃6⁃indolecarbamidine dihydrochlori⁃de，DAPI（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.1.3 引物和探针原位锁式探针实验的荧光检测探针来源于文献［7］，引物和检测探针使用Inte⁃grated DNA technology 网 站（https：//sg.idtdna.com/pages）进行设计，并在Blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）网站的refseq_rna 数据库中行序列比对以获取特异性的引物（引物，锁式探针和检测探针序列见表1-2）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养细胞，并将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中，待细胞汇合度为80%～90%时采用0.25%胰蛋白酶消化收获细胞。

1.2.2 提取WBC按照说明书使用Lymphoprep试剂提取健康体检者外周血WBC，具体操作如下：在15 mL离心管中加入Lymphoprep分离液2 mL，取2 mL 3%FBA⁃PBS 稀释等量全血，稀释后血液叠加在Lymphoprep分离液上，1 200 g离心10 min后弃上清，3%FBS⁃PBS 离心洗涤后收集WBC 沉淀。

1.2.3 肿瘤细胞和WBC 的PRKAA2 mRNA 定量检测按照TRIZOLTM 试剂说明书步骤分别抽提肿瘤细胞和WBC 的总RNA。使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒逆转录RNA，取1 μg RNA 合成cDNA。采用FastFire qPCR PreMix试剂盒用于qRT⁃PCR 反应，反应体系为20 μL。引物序列见表1，GAPDH 作为内参基因。反应程序如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸15 s，共40个循环。使用LightCycler 480实时荧光定量PCR仪检测样本荧光信号。使用2⁃ΔΔCT法计算基因相对表达量。

表1 荧光定量PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of fluorescence quantitative PCR

1.2.4 原位锁式探针杂交实验（1）制片：掺入实验中，将对数生长期的肿瘤细胞消化成单个细胞，加入终浓度为5 μmol/L 的细胞追踪染料CFSE（溶于1 mL PBS 中）后37 ℃水浴20 min，加5 mL 完全培养基37 ℃水浴30 min，PBS 清洗3 次，获取细胞沉淀。肿瘤细胞、WBC和WBC混合CFSE标记肿瘤细胞置于细胞甩片离心机，1 600 r/min 离心3 min，制成细胞玻片样本，3.7%多聚甲醛固定10 min，-20 ℃冰箱保存。（2）杂交实验：详细过程参照文献［9］，主要程序包括以下步骤：（1）加入Revertaid H minus RT 酶逆转录体系，45 ℃孵育3 h；（2）加入Rnase H，Ampligase®DNA Ligase 酶体系37 ℃孵育30 min，45 ℃孵育45 min；（3）加入Phi29 DNA polymerase 酶体系室温滚环扩增过夜；（4）加荧光标记检测探针置于37 ℃孵箱杂交30 min；（5）最后用1∶5 000 DAPI 复染细胞核，再滴加Slowfade gold antifade reagent 抗淬灭封片剂封片，4 ℃保存；（6）共聚焦荧光显微镜成像和分析。

1.3 统计学方法使用SPSS 25.0 软件进行统计分析，数据采用均数±标准差表示，正态分布两组均数比较采用t检验，方差不齐时则采用校正t检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

表2 原位锁式杂交实验的引物和探针序列Tab.2 Primer and probe sequences for in situ padlock hybridization experiments

2 结果

2.1 PRKAA2 在WBC 与多种肿瘤细胞中的表达水平THPA 数据库（https：//www.proteinatlas.org/）的RNA 测序数据［8］显示PRKAA2 基因在WBC 中几乎不表达（图1A）。应用qRT⁃PCR 实验，验证该基因在HepG2、U87、Hela、PC⁃3 细胞系和WBC 中的表达差异，结果见图1B、表3，HepG2、U87、Hela和PC⁃3 细胞系中的PRKAA2 mRNA 水平显著高于WBC，差异具有统计意义（均P<0.05）。

图1 PRKAA2 在WBC 与多种肿瘤细胞系中的表达水平Fig.1 The mRNA level of PRKAA2 in WBC and multiple tumor cell lines

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC⁃3、HepG2 和WBC细胞中相对表达量（2⁃ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC⁃3，HepG2 cancer cells and WBC（2⁃ΔΔCT）±s

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC⁃3、HepG2 和WBC细胞中相对表达量（2⁃ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC⁃3，HepG2 cancer cells and WBC（2⁃ΔΔCT）±s

注：P 值均为与WBC 比较所得

⁃ΔΔCT 样本WBC Hela U87 PC⁃3 HepG2 PRKAA2（2）1.12±0.73 429.40±109.6 206.18±15.5 57.11±7.67 778.70±156.9 P 值0.002 0.002<0.001 0.013

2.2 PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela、PC⁃3 细胞中特异性高表达使用ACTB基因作为阳性对照，原位锁式探针技术检测HepG2、U87、Hela、PC⁃3 细胞系和WBC的PRKAA2 mRNA，结果见图2，HepG2、U87、Hela 和PC⁃3 细胞显示为DAPI+/PRKAA2+/ACTB+，而WBC 显示为DAPI+/PRKAA2-/ACTB+，表明PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela 和PC⁃3 细胞中特异性高表达。

图2 肿瘤细胞HepG2、Hela、U87、PC⁃3 与WBC 的PRKAA2 mRNA 信号荧光图 标尺：10 μM（放大倍数400×：目镜10×，物镜40×）Fig.2 Fluorescent images of PRKAA2 mRNA in cancer cells（HepG2，Hela，U87，PC⁃3）and WBC（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

2.3 检测PRKAA2mRNA 荧光信号可准确鉴定肿瘤细胞实验采用原位锁式探针杂交技术检测PRKAA2 以识别CTCs。HepG2、U87、Hela 和PC⁃3肿瘤细胞被预先标记CFSE 荧光染料并掺入1 mL健康体检者外周血中以模拟临床样本，内参基因ACTB 作为阳性对照。结果见图3，WBC（DAPI+/CFSE-）未检测到PRKAA2 信号，而几乎所有肿瘤细胞（DAPI+/CFSE+）均检测到PRKAA2 信号。CFSE 和PRKAA2 在共聚焦荧光显微镜下实现良好的荧光信号共定位，表明检测PRKAA2 mRNA 荧光信号可准确鉴定肿瘤细胞。

图3 PRKAA2 mRNA 与CFSE 共定位荧光图（放大倍数400×：目镜10×，物镜40×）Fig.3 Fluorescent images show co-localization of PRKAA2 mRNA and CFSE（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

3 讨论

脂肪由磷脂、脂肪酸、甘油三酯、鞘脂、胆固醇和胆固醇酯等分子组成，是所有细胞膜的重要组成部分，也是特定条件下细胞的重要能量来源［9-10］。脂质代谢异常是众多代谢性疾病，如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、胰腺炎发生发展的关键因素［11-14］。越来越多的证据［15-17］表明，脂肪代谢异常即脂代谢重编程有利于癌细胞的存活、增殖、侵袭和转移，在肿瘤恶性生物学行为中起着关键的作用。因此，靶向脂质代谢调节相关通路已成为一种新的抗癌策略［18-19］。

本实验室长期致力于CTCs 的富集和鉴定的研究，经脂代谢基因芯片筛选发现PRKAA2 在肝癌细胞中的表达水平显著高于WBC。本研究发现，除了肝癌细胞，在前列腺癌、宫颈癌、胶质瘤等细胞中其表达量均和WBC 有统计学差异，这和PRKAA2 的功能密切相关：PRKAA2 基因编码腺苷酸活化蛋白激酶（AMP⁃activated protein kinase，AMPK）的α2 催化亚基蛋白，该蛋白通过磷酸化乙酰辅酶A 羧化酶1（ACC1）、磷酸化线粒体相关亚型ACC2 和介导转运蛋白CD36 转位到质膜，达到抑制脂肪酸合成、上调脂肪酸氧化水平、激活脂肪酸摄取的效果，从而在应激条件下维持肿瘤细胞的代谢稳态［20］。由于肿瘤细胞与正常细胞的脂代谢差异，PRKAA2 作为一个潜在的“通用型”肿瘤细胞标志物的优势如下：（1）可从细胞代谢功能上直接辨别癌与非癌，特异性高；（2）不局限于某种特定肿瘤细胞，有望提高CTCs 检测通量，并且省时、经济。因此，PRKAA2 有望成为极具潜力的CTCs 鉴定标志物。

本研究使用的原位锁式探针杂交技术整合了滚环扩增法，可在细胞原位检测单个PRKAA2 mRNA 信号，具有灵敏度高、特异性强和信噪比高的特点［7］，为得到准确可靠的实验结果提供坚实的技术保障。我们将肿瘤细胞掺入外周血模拟CTCs，采用原位锁式杂交技术可视化检测PRKAA2荧光信号，结果表明对PRKAA2 的荧光信号检测可从大量背景WBC 中准确识别肿瘤细胞，为PRKAA2 用于CTCs 的鉴定提供理论基础和技术保障。

总之，本研究初步证实，检测标志物PRKAA2可特异鉴定多种类型的肿瘤细胞，并有望准确定量多种癌症起源CTCs，对肿瘤的辅助诊断、治疗检测和预后评估等提供重要的临床价值。然而，本课题局限于体外实验，尚未进行体内实验，后续的研究中会纳入多肿瘤类型及扩大样本量，来进一步验证PRKAA2 作为泛癌CTCs 鉴定标志物的临床应用价值。