MrgD通过抑制内质网应激调节肝癌细胞脂肪酸代谢

区婷婷，曾楠，杜弢

细胞内的脂肪代谢对于维持细胞正常的能量代谢和细胞内环境稳态发挥着不可忽视的作用，肿瘤细胞异常增殖所需能量供应除了增加葡萄糖摄入消耗供能外，也可通过增加脂肪代谢供能［1］。有研究发现减少脂肪积累或者减弱脂质代谢可影响前列腺细胞的癌变进程［2］，另有研究指出脂肪代谢与肿瘤细胞耐药和化疗不敏感度有关［3，4］，这些研究提示靶向脂肪酸合成可能成为肿瘤治疗的新策略［5］。

最近的一项研究发现抑制脂肪酸和胆固醇的合成可以有效降低肝癌的发生［6］。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在肝细胞脂肪变性和肝癌进展中发挥重要作用，许多疾病如高脂血症、炎症、病毒等可干扰肝细胞ER的体内稳态，进而导致肝脂质代谢失调与肝细胞的炎性坏死、凋亡，促进肝脏疾病的发生发展［7］。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）中ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴对维持机体肝脏脂代谢的稳态非常重要［8，9］。其中Mas受体可缓解ERS诱导剂毒胡萝卜素诱导的HepG2细胞的ERS，从而减少HepG2细胞内甘油三酯的积累［10］。Mas受体相关G蛋白偶联受体D（MAS-related G-protein Coupled Receptor member D，MrgD），又称为MrgprD或TGR7，与Mas受体具有一定比例的同源性。这两个受体对机体的血管与心脏等发挥类似的保护作用，如舒张血管［11，12］、抗心肌纤维化、抗心室肥大［13，14］等。目前，关于MrgD对肝癌细胞脂肪代谢方面的作用尚不清楚，本研究将初步探讨MrgD调控肝癌细胞脂肪代谢和ERS的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HepG2及其稳定转染细胞株在含10%FBS的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 构建过表达与干扰MrgD的稳定HepG2细胞株

将pcDNA3-MRGD-EGFP表达质粒质粒（Addgene）的人源MrgD全长序列克隆插入CMV-eGFPPGK-Puro表达载体质粒中的eGFP，获得MrgD表达载体PGMLV-CMV-H_MRGD-eGFP-PGK-Puro。同时，设计针对人源MrgD序列干扰的MrgD-shRNA质粒，插入PGMLV-SC5载体，构建MrgD干扰载体H_MRGD-shRNA1（PGMLV-SC5）。上述质粒载体均带有嘌呤霉素筛选抗性。用构建的慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞，收集病毒原液，超滤浓缩并测定病毒滴度。用包装好的慢病毒以及慢病毒阴性对照感染HepG2细胞并用嘌呤霉素筛选，得到目的转染稳定细胞株，qRT-PCR评估MrgD表达变化。

表1 MrgD shRNA oligo序列

1.3 HepG2细胞脂肪变性模型的构建与验证

1.3.1 在1%BSA低糖DMEM培养基中，以油酸和棕榈酸按一定比例配置200 μM游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA），用于诱导细胞脂肪变性模型。

1.3.2 选用生长状态良好的对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化、离心、重悬后，计数按5.0×104/孔的密度铺于24孔板（6孔板则按1.5×105/孔种板），隔夜培养细胞稳定贴壁后，细胞密度约70%，对照组每孔加入500 μL（6孔板按2 mL/孔）含1% BSA的低糖DMEM培养基，模型组每孔加入等体积的200 μM FFA高脂培养基（由1% BSA的培养基稀释），继续培养12 h。

1.3.3 油红O染色观察细胞脂质沉积：油红O粉末（Sigma），以异丙醇溶解配置0.5%油红O母液，与ddH2O按3∶2比例混匀后过滤配置工作液，按试剂标准步骤对4%多聚甲醛固定后的细胞进行染色观察。

1.4 Western Blot法检测相关蛋白表达

提取细胞蛋白进行蛋白浓度的测定及调配后，以10%SDS-PAGE凝胶进行电泳后转膜。用一抗稀释液按1∶1000分别稀释相如下的抗体：并下调固醇调节元件结合蛋白2（Sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）（CST）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC1）（CST）、免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip）（CST）、GAPDH（Santa），置4℃缓慢摇床中孵育过夜，用含5%脱脂牛奶的1×TBST按照1∶5000的比例稀释二抗；ECL法显影，用Image J软件各目的条带的灰度值进行分析。

1.5 qRT-PCR检测相关mRNA表达

Trizol法提取细胞总RNA，参照TaKaRa RR036A逆转录试盒说明书，将细胞RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR参照TaKaRa RR820A（TB Green Premix Ex TaqⅡ）说明书，使用Roche LightCycler®480Ⅱ进行qRT-PCR程序。通过内参基因的Ct值计算出目的基因的相对表达量。以Folds=2-ΔΔCt公式比较目的基因的表达差异，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）处理组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组。qRT-PCR引物序列：H_MRGPRD-F：GCTGTTCGTGGTGGTCCTG；H_MRGPRD-R：GGAGAGGCGTGACAAGCTG；H_GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG；H_GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.6 细胞免疫荧光

对数生长期的细胞消化重悬后计数，按8×104/孔于24孔板中均匀种板，细胞贴壁后当细胞达到约40%汇合度进行免疫荧光观察。MrgD一抗和二抗Cy3均按1∶500比例稀释；按标准步骤进行抗体孵育后，在荧光显微镜下，选择抗体对应的激发光源，观察、采集图像。

1.7 统计学分析

采用SPSS 2.0统计软件进行分析，实验数据采用均数±标准误（±s），采用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计、作图，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HepG2的MrgD过表达与干扰稳定株的构建与鉴定

对构建的人源MrgD表达载体PGMLV-CMVH_MRGD-eGFP-PGK-Puro和含有MrgD序列干扰的MrgD-shRNA质粒测序鉴定正确后，构建的慢病毒载体转染HepG2细胞，得到稳定表达细胞株，通过qRT-PCR与Western Blot分别检测细胞株MrgD的mRNA与蛋白水平。qRT-PCR（图1A）结果显示过表达细胞MrgD的mRNA水平较对照细胞显著上升（P＜0.001），4组shRNA干扰组细胞MrgD的mRNA水平较其对照组明显降低（P＜0.001），其中shRNA3最低，后续试验均选用感染shRNA3序列细胞株；免疫荧光显示的MrgD蛋白表达有同样的趋势（图1B）。

图1 过表达和低表达MrgD的HepG2稳定株的建立与鉴定A：qRT-PCR检测细胞MrgD mRNA表达水平，以GAPDH为内参；B：免疫荧光观察细胞MrgD蛋白表达。Lv-Con：过表达对照组；Lv-MrgD：MrgD过表达组；Sh-Con：干扰对照组；Sh-MrgD：MrgD干扰组；*P＜0.001。

2.2 体外脂肪变性模型的构建

采用含200 μM的由棕榈酸（palmitic acid，PA）和油酸（oleic acid，OA）混合的FFA脂性培养基刺激HepG2细胞12 h。设置4个分组：对照组（1%BSA处理）以及OA∶PA比例分别为1∶2、1∶1、2∶1的FFA处理组，之后用MTS测定各组细胞的活性。结果显示200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）处理细胞12 h不影响细胞活性（图2A），故选用该方案诱导细胞脂肪变性并进行油红O染色。结果显示，与1%BSA培养基处理的对照组对比，FFA处理的HepG2细胞内的橘红色脂滴显著增加（图2B）。

图2 FFA诱导HepG2细胞脂滴堆积分别用含1%BSA（模型对照组）与含200 μM FFA的低糖DMEM培养基（模型组）培养HepG2细胞12 h A：MTS检测200 μM的FFA（OA∶PA=1∶2、1∶1、2∶1）的处理HepG2细胞12 h的活性。*P＜0.05，**P＜0.01。B：200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）诱导细胞12 h的油红O染色。

2.3 MrgD改善FFA诱导的肝细胞脂肪变性与内质网应激

为探究MrgD是否对肝脏脂肪代谢有影响，通过油红O染色观察MrgD过表达对FFA诱导后细胞内脂滴沉积含量的影响，Western blot检测脂肪合成相关蛋白（ACC1）以及ERS标记蛋白（BiP、ATF4）水平。结果显示，在HepG2脂肪变性模型中，MrgD过表达明显抑制了FFA诱导的显著增加的脂滴蓄积（图3A）；FFA诱导后，对照组细胞脂肪合成标记蛋白SREBP2、ACC1和ERS标记蛋白BiP水平上调，而过表达MrgD下调了上述蛋白的表达（图3B）。

图3 MrgD对肝细胞脂肪变性的影响用200 μM的FFA诱导MrgD过表达组及其对照12 h，进行后续实验的验证A：油红O染色观察各组脂滴沉积情况；B：Western Blot检测过表达组的脂肪合成相关蛋白（ACC1、SREBP2）与ERS标记蛋白（BiP）水平。

2.4 干扰MrgD促进FFA诱导的肝细胞脂肪变性与内质网应激

同时，MrgD干扰HepG2细胞脂肪变性后，油红O染色发现，相对于对照组，MrgD干扰后FFA诱导的脂滴合成显著增加（图5A）；相应的脂肪合成标记蛋白SREBP2、ACC1表达水平显著上调，同时ERS标记蛋白BiP表达水平增高（图5B）。

3 讨论

脂质代谢失调和炎症是癌细胞的常见表型［15］，细胞内脂肪酸作为膜脂、信号分子和修饰基团的生物合成前体为肿瘤生长提供能量储存［16］。脂质合成、摄取和储存通常在肝癌发生中上调，靶向脂质代谢可能是一种有前途的癌症治疗方法［17］。本研究发现在肝脏肿瘤细胞株HepG2中上调MrgD表达可通过抑制脂肪合成、改善ERS途径显著改善肝癌细胞脂肪变性，研究提示MrgD相关通路可能成为研究肝癌防治策略的新方向。

图4 干扰MrgD对肝细胞脂肪变性的影响A：经FFA诱导后各组的油红O染色；B：Western Blot检测FFA诱导后各组的脂肪合成相关蛋白（ACC1、SREBP2）与ERS标记蛋白（BiP）。

FFA常用于诱导建立脂肪变性细胞模型［18，19］，油酸（OA）和棕榈酸（PA）是体内常见的FFA，可合成甘油三酯并储存于肝细胞胞质中。体内甘油三酯含量过高会导致肝细胞脂肪变性，FFA能激活内质网应激的3条信号通路［20］。ERS的激活可导致肝脂质代谢失调与肝细胞的炎性坏死、凋亡，在肝细胞脂肪变性和肝癌进展中发挥重要作用［7］。本研究应用200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）诱导HepG2细胞脂肪变性，造模后肝细胞ERS及脂肪合成相关基因的mRNA和蛋白水平显著升高。

RAS对维持机体肝脏脂代谢的稳态非常重要，Mas受体是其中关键的一员，Mas受体敲除小鼠表现出肝脏脂质蓄积增强和脂肪合成相关蛋白上调，而过表达Mas受体则会扭转上述变化趋势［21］。MrgD受体是与Mas受体有一定比例同源性，与Mas受体发挥许多相似的生理作用，但其MrgD在肝细胞脂代谢中的作用尚不清楚。本研究通过构建FFA诱导的MrgD受体过表达与干扰的HepG2细胞脂肪变性模型，发现高表达MrgD明显降低FFA诱导的胞质内脂质含量，并下调固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）和乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）。SREBP2是参与脂质合成的调控关键转录因子。已有研究表明［22，23］，SREBP2表达受AdipoR1/AMPK/SIRT1信号通路调控的，AMPK激活后也可直接作用于SREBP2，使其磷酸化，进而下调SREBP2的靶基因，如参与胆固醇和脂肪酸生物合成等相关基因的转录。ACC1同样在脂肪酸合成中起主要作用。ACC是一类生物素羧化酶，其催化乙酰辅酶A和碳酸酯的ATP依赖性缩合以形成丙二酰辅酶A，后者是从头脂肪生成的必需和限速底物，也是肝脏组织细胞中长链脂肪酸β-氧化的关键调节酶CPT-1（Carnitine palmitoyltransferase 1，肉毒碱-棕榈酰转移酶1）的变构抑制剂［24］。

此外，本研究发现高表达MrgD可抑制免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip），同时在低表达MrgD细胞中观察到相反的结果。BiP是一种高度保守的分子伴侣，它充当Ca2+的调节剂协助蛋白质转运到内质网，并通过其两个结构域核苷酸结合域和底物结合域协助内质网中蛋白质的折叠过程。BiP作为维持内质网功能稳态的重要调节剂，可激活涉及未折叠蛋白反应的基因的转录，也是ERS的主要标记物［25］。已有的研究表明，FFA作用肝细胞后，脂肪合成基因SREBP-1c和BiP的mRNA和蛋白水平以及脂肪酸合成酶mRNA显著增加，参与肝细胞脂肪变性过程［26］。这些研究结果提示MrgD可能通过调控ERS参与调节肝癌细胞脂肪合成。

综上，本研究在体外初步揭示了MrgD通过调控内质网应激抑制肝癌细胞脂肪合成。调节肝细胞的脂质代谢异常及缓解ERS的机制，从而阻止或延缓肝脏脂肪变性和肝癌的发生发展，有望成为肝癌防治的一个有效方法，本研究有助于深入研究MrgD通路在肝癌细胞脂肪变性中的作用和机制，探讨其在肝癌防治中的潜在价值。