佛坪自然保护区野生大熊猫寄生虫风险分析

马亦生，张振华，金艺鹏 ，陈原玉，赵凯辉，文一帆，韦思远，高宇航

(1.陕西佛坪国家级自然保护区管理局，陕西 汉中 723400；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是中国独有的珍稀动物资源，被列为国家I级重点保护野生动物和CITES附录I级物种，主要分布于陕西、四川以及甘肃山区。近年来，我国在野生大熊猫保护及圈养大熊猫繁育方面均取得了显著成效[1]。相较于圈养大熊猫，野生大熊猫很难得到良好的医疗管理，其平均寿命仅为18～20 a，远低于圈养大熊猫(30 a)。野生大熊猫死亡原因很多，其中与寄生虫病不无关系。迄今，大熊猫疾病研究以圈养者为主，野生大熊猫疾病研究报道较少，且主要集中在消化系统疾病、呼吸系统疾病、神经系统疾病、造血系统疾病、寄生虫疾病等方面[2]，寄生虫病研究虽一直进行，但其感染情况、传播途径、发病机理依然不甚明确；迄今发现感染大熊猫的寄生虫共计26种，晏培松等[3]、何承德等[4]在对死亡大熊猫进行剖检时发现了槽盘吸虫虫体，赖从龙等[5]检测野外大熊猫粪便发现了大熊猫槽盘吸虫卵，检出率为0.48%(13/2680)，Liu C K等[6]在四川松潘大熊猫体内检出过犬钩口线虫雌虫，杨光友等[7]研究发现野生大熊猫粪便中钩虫卵感染量可达93.3%(14/15)。姜泰京等[8]人在四川的大熊猫体内采到线中殖孔绦虫虫体50余条。研究表明施氏贝蛔虫是大熊猫(无论圈养还是野生)体内最常见、危害最大的消化道寄生虫，有致死危险，且为大熊猫所独有。

本研究对在陕西佛坪国家级自然保护区内收集到的121份野生大熊猫粪便样品，进行寄生虫形态学鉴定，结合粪便样本地理位置信息，对寄生虫在保护区内的空间分布情况和不同寄生虫之间的关系进行探究，以期初步探明该保护区内的大熊猫寄生虫分布情况并评估其风险，为大熊猫保护和寄生虫病防控提供依据和指导。

1 研究方法

1.1 粪便样本的采集、保存与运输

1.1.1 样本采集 2017年4月，在保护区的3个保护站(岳坝保护站、大古坪保护站、三官庙保护站)周边，沿不同线路采集样品。记录每份样品采集日期、粪便新鲜程度、采集地点的位置信息并编号。共在31条线路94个采样点，收集野生大熊猫粪便样本121份。

粪便新鲜程度的判定按照以下标准:新鲜(1～3 d)：表面黏液完整，有光泽，触摸光滑细腻，打开有清香竹味，表里色泽相同无霉菌;较新鲜(4～15 d)：表面无黏膜，出现少量霉菌，粪团稍松散,干燥环境下表层薄纸状略带光泽黏膜;不新鲜(>15 d)：外形松散，有霉味，霉菌遍布表面，菌丝长约1～2 cm;天气干燥时呈干裂状。

1.1.2 样本保存与运输 将每天采集到的粪便样本，每份分装于5个5 ml 的离心管中，剩余部分放入塑封袋。全部样本冻存于-20 ℃冰箱。在运输过程中用冰袋保持低温。

1.2 样本检测

1.2.1 试剂与仪器 NaCl 固体(国药集团化学试剂有限公司),显微镜(DM 500，Leica), Leica Application Suite软件。医用纱布、粪杯、滴管、15 ml 离心管、50 ml 离心管、20 ml 试管、60目铜筛、盖玻片、载玻片，均由北京爱普瑞晟科技有限公司提供。

1.2.2 样本初步检测 在管护站对每天采集到的大熊猫粪便样品，采用直接滴片法和饱和盐水漂浮法检测。操作步骤如下:

(1) 粪便的外观检查

判断粪便新鲜程度，记录主要组成成分，检查是否有肉眼可见的寄生虫。

(2) 粪便镜检

取约2 g粪便(粪便中心位置)于粪杯中，加入10 ml清水 ，用滴管充分搅拌混匀，取3滴镜检，观察并记录粪便中是否有纤毛虫、原虫、线虫幼虫、虫卵及其他。

(3) 分离镜检样品

在(2)步骤的同时，另取2 g粪便(粪便中心位置)于粪杯中，加入10 ml饱和食盐水，用滴管充分搅拌混匀，经一层纱布过滤至15 ml离心管中，滴加饱和食盐水至凸液面，将盖玻片置于其上，静置30 min后，取下盖玻片放在载玻片上，供镜检。

(4)显微镜检查

将盖玻片放在载物台中间，打开光源，先用4倍物镜观察，调节校准焦螺旋至视野清晰，将视野放到盖玻片左上角，按照由上到下、由左至右的方向有规律的扫查整个液面，当看到疑似寄生虫虫卵或幼虫的结构时，将目标放到视野中央，转换为10倍物镜观察。记录每份样本的寄生虫检出情况。

1.2.3 实验室检查 在实验室，将存放在-20 ℃环境下的样本再次进行显微镜复检，并将粪便溶液浓缩，以提高寄生虫的检出率。镜检时，及时对发现的寄生虫(卵)进行拍照记录。操作方法如下：

(1)水洗沉淀法

取约5 g粪便于粪杯中，加入50 ml清水，充分搅拌混匀，经60目铜筛过滤至50 ml离心管中，静置30 min，弃上清45 ml。反复3次。

(2)饱和盐水漂浮

将上步剩余的5 ml液体，用移液枪转移到20 ml 试管中，加饱和食盐水至凸液面，静置30 min。用滴管蘸取试管凸液面表面液体至1.5 ml EP管中。每份样品约收集粪便溶液100～200 ul。

1.3 寄生虫形态学鉴定依据

根据显微镜下观察到的形态学特征，对寄生虫进行分类。为保证检出结果更为有效，将显微镜下观察到的生命体分为施氏贝蛔虫虫卵、槽盘吸虫虫卵、其他虫卵、线虫幼虫、原虫、真菌、花粉、节肢动物等8种。

施氏贝蛔虫：属于线虫动物门(Nemetoda)尾感器纲(Phasmida) 蛔目(Ascaridida)蛔科(Ascaridida)贝蛔属(Baylisascaris)，常寄生于大熊猫小肠内，但在口腔、气管和胃内都曾发现成虫。贝蛔属的虫卵具有明显特征:形状为两头圆润的椭圆形，黄色或暗黄色，长度约67～83 μm，宽度54～77 μm。卵壳比其他线虫卵厚很多，有三层膜结构。内膜薄而透明，不易观察到;第二层为较厚透明的几丁质外壳;最外层为蛋白质外壳，其上有密集的高约为5.67～10.80 μm的棘状突起，可根据这一特征区分施氏贝蛔虫虫卵与其他虫卵。若在检查中观察到该形态的虫卵，则记为施氏贝蛔虫虫卵阳性。

槽盘吸虫：属于扁形动物门(Platyhelminthes)吸虫纲(Trematoda)复殖目(Digenea)背孔科(Notocotylidae) 槽盘属(Ogmocotyle)，是引起大熊猫吸虫病的主要病原，成虫寄生于大熊猫十二指肠内。槽盘吸虫虫卵呈长20 μm，宽15 μm的椭圆形，虫卵两端各有一条卵丝，长短不一。若在检查中观察到该形态的虫卵，则记为槽盘吸虫虫卵阳性。

其他虫卵：若在显微镜中观察到有膜结构且内部结构清晰的虫卵，记为其他虫卵阳性。

线虫幼虫：将在显微镜中观察到的活动性强、呈线条状，能区分头部、尾部，且虫体内部能看清消化道结构的幼虫，记为线虫幼虫阳性。

原虫：可感染野生动物的原虫种类众多，形态各异[4]。仅对粪便中观察到的滴虫和球虫做记录。在直接滴片时观察，可见游走性强的虫体;在400倍镜下，可见卵囊。

真菌：对保护区内正常生长的竹子和散落的竹叶进行观察，若出现真菌的结构，则记为真菌阳性。

花粉：观察保护区环境中的花粉颗粒，若出现花粉的结构，则记为花粉阳性或真菌阳性。

节肢动物：将在粪便中观察到螨虫或螨虫卵的记为节肢动物阳性。

1.4 制图和风险分析

利用ArcToolbox进行施氏贝蛔虫分布制图和风险分析。

2 研究结果

2.1 施氏贝蛔虫检测情况

实验中，通过Leica Application Suite 软件连接显微镜，记录、测量了20个施氏贝蛔虫的虫卵。虫卵呈黄色或棕黄色，椭圆形;卵壳表面有棘状突起。根据邬捷[9]等人对施氏贝蛔虫虫卵发育期的观察，可知熊猫蛔虫虫卵的整个发育过程可分为八个时期:原胚期、二球期、四球期、八球期、桑葚期、囊胚期、蝌蚪期和幼虫期。在本研究中，可见原胚期、二球期、四胚期和囊胚期虫卵。此外，试验测量的20个虫卵的大小，其长65.1～93.6 μm(平均82.6 μm)，宽47.8～62.8 μm(平均55.5 μm)，与已有的形态学研究结果一致。

2.2 寄生虫检出情况

在陕西佛坪国家级自然保护区内收集的121份野生大熊猫粪便样本中，28份未检出寄生虫，93份检出寄生虫，总检出率为76.1%。

121份样本中，33份样本中检出施氏贝蛔虫虫卵、检出率27.3%，5份样本中检出槽盘吸虫虫卵、检出率4.1%，42份样本检出其他虫卵、检出率34.7%，61份样本中检出线虫幼虫、检出率50.4%，16份样本中检出有原虫、检出率14.0%。另外，21份样本中检出节肢动物，2份样本中检出真菌，31份样本中检出花粉。 说明不同寄生虫的检出率差别较大，其中，线虫幼虫的检出率最高，对大熊猫潜在危害最大的施氏贝蛔虫检出率也较高，槽盘吸虫虫卵检出率最低，高于赖从龙等[5]人在20世纪九十年代得出的检出率。整体来看，佛坪保护区大熊猫粪便寄生虫寄生状况好于现有研究报道的区域。

A 虫卵原胚期 B 虫卵二球期 C 虫卵四球期 D 虫卵囊胚期图1 施氏贝蛔虫(400倍)

图2 采样点分布图

2.3 不同新鲜程度样本寄生虫检出情况

从不同新鲜程度样本的寄生虫检出率图(图3)看出，施氏贝蛔虫虫卵、槽盘吸虫虫卵和真菌的检出率新鲜样本最高，其他虫卵、线虫幼虫和原虫较新鲜样本检出率最高。可能是因为随着时间的推移，外界环境(主要是土壤和气候)对粪便产生的影响。对于粪便中的微生物(如大肠杆菌)来说，施氏贝蛔虫、槽盘吸虫和真菌的蛋白质外壳是很好的营养物质，所以在微生物大量增殖的过程中，出现了较新鲜(4～15 d)组施氏贝蛔虫、槽盘吸虫和真菌的检出率低于新鲜组(1～3 d)的结果。某些肠道寄生线虫在随粪便排出体外后，会在适宜的温度、湿度下，迅速发育，成长为线虫幼虫;同时土壤中本来存在的某些线虫，会进入到营养较为丰富的粪便中，利用所需能量后离去;而原虫在粪便刚排出体外时活力很强，在短时间内利用营养物质增殖，但其对生存的环境温度等要求较为严格，因此在体外无法长时间生存。这可能是导致线虫幼虫、其他虫卵和原虫在较新鲜组的检出率最高的原因。

图3 不同新鲜程度分组的寄生虫检出率比较

新鲜组和非新鲜组(较新鲜组和不新鲜组的总和)的寄生虫检出率分析比较结果为，新鲜组和非新鲜组的蛔虫虫卵、槽盘吸虫虫卵、其他虫卵、线虫幼虫和原虫的P值分别为0.023(P<0.05)、0.02(P<0.05)、0.032(P<0.05)、0.004(P<0.05)和 0.703 (P>0.05)，说明除原虫外，野生大熊猫粪便的新鲜程度对其中寄生虫的检出结果会造成显著影响。

2.4 寄生虫风险分析

从利用 ArcToolbox制作的保护区施氏贝蛔虫空间分布图(图4)可看出，具有统计学上显著的“热点”(置信度95%)集中在三官庙站区内，而“冷点”集中在岳坝站区内(置信度90%～95%)，在其他地段没有显著的高值或低值的空间聚类。

图4 检出施氏贝蛔虫样本的冷热点

4 结论与讨论

佛坪自然保护区野生大熊猫粪便中存在多种寄生虫，其总检出率76.1%，其中，施氏贝蛔虫虫卵检出率27.3%，槽盘吸虫虫卵检出率4.1%，原虫检出率14.0%，其他虫卵检出率34.7%，线虫幼虫检出率35.7%。除原虫外，粪便新鲜程度对寄生虫的检出结果会造成显著影响。大熊猫独有且体内最常见、危害最大的消化道寄生虫——施氏贝蛔虫分布“热点”在三官庙站区。

野生大熊猫施氏贝蛔虫分布“热点”就是具有统计意义的高值聚集空间，如果某处出现蛔虫检出结果呈阳性，则周围极也可能出现阳性，也就是说在“热点”范围内，若有一处爆发蛔虫病，则很可能会波及周围地区，造成严重的后果。佛坪保护区大熊猫施氏贝蛔虫分布“热点”——三官庙站区域，处于核心区与缓冲区交界带，常年有多只大熊猫活动，应强化该区域的监测监控措施。 本次研究将粪便的新鲜程度作为关键因素探究分析了不同新鲜程度下野生大熊猫粪便样本的寄生虫检出情况，结论为野生大熊猫粪便新鲜(1～3 d)状态下的检测结果的可信度更高，忽略粪便新鲜程度的检测结果不能准确反映大熊猫寄生虫感染情况，故野生大熊猫寄生虫病风险分析研究，应该采集新鲜(表面黏液完整，有光泽，触摸光滑细腻，打开有清香竹味，表里色泽相同无霉菌)粪便。