替米沙坦对尿酸盐刺激下HK-2肾小管上皮细胞干预研究*

张继波，龙利，覃慧群，金晟，余建峰，徐敏，刘浩

(湖北省第三人民医院肾病内科，武汉 430033)

高尿酸血症是引起慢性肾脏疾病的独立危险因素，并可导致肾脏纤维化。过氧化物酶增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)与配体结合激活后，主要通过调节靶基因的表达产生生物效应，包括抑制促炎性递质[如白细胞介素-6(IL-6)、环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)]表达，改善炎症状态[1]，降低转化生长因子-β1(TGF-β1)和单核巨噬细胞因子-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)表达，起到抗肾间质纤维化作用[2-3]。单钠尿酸盐刺激肾小管上皮细胞可以诱导HK-2细胞产生氧化应激反应[4]、自噬表达增加[5]，甚至随着尿酸盐浓度增加，HK-2细胞增殖能力下降，导致小管细胞凋亡[6]。血管紧张素Ⅱ可下调PPAR-γ表达[7]，替米沙坦具有激活PPAR-γ受体的作用[8]，通过提高血清、肾组织中PPAR-γmRNA表达而降低肥胖大鼠尿白蛋白，有肾保护作用[9]。陈艳梅等[10]通过对大鼠肾组织及HK-2细胞培养研究发现，调节人生电型尿酸盐转运蛋白(human electric urate transporter，hUAT)表达，替米沙坦能抑制肾小管上皮细胞TGF-β1及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达，对尿酸性肾病肾脏纤维化有一定的保护作用。这种保护作用是否是通过PPAR途径产生，目前笔者尚未见类似报道，本研究主要通过PPAR途径研究替米沙坦对尿酸盐刺激下HK-2肾小管上皮细胞的干预机制，探讨替米沙坦对尿酸性肾病肾保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞 HK-2人肾小管上皮细胞，购自中国科学院细胞库(中国上海)。

1.1.2试剂 胎牛血清(FBS，批号：567216)购于GIBCO公司；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四醋酸(EDTA)(批号：160526061)、青霉素-链霉素(批号：659R063)购于北京索莱宝科技有限公司；PPAR-γ阻断剂GW9662(批号：062R1598T)、尿酸(批号：STBC0603V)购于美国Sigma公司；TrizolRNA提取试剂(批号：156987)购于美国Invitrogen公司；TaqTMⅡPCR试剂盒(批号：AE265988)、逆转录试剂盒(批号：AC32659C)购于TaKaRa公司；引物购于上海生工生物工程有限公司；罗格列酮片(规格：每片1 mg，批准文号：国药准字H20041422)，成都恒瑞制药有限公司；替米沙坦片(规格：每片40 mg，批准文号：国药准字J20180016)，Boehringer Ingelhein Ellas A.E。

1.1.3仪器 二氧化碳(CO2)细胞培养箱购置于美国Thermo公司；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；CK-TKc-3倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)；酶联免疫检测仪(芬兰Thermol Labsystems)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；低速离心机(上海医疗仪器厂)；磁力搅拌器(苏州国华仪器厂)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器公司)；微量移液器(德国Appendorf公司)；流式细胞仪(美国BD亚洲有限公司)；紫外分光光度计(美国Thermo公司)；自动压力蒸汽灭菌器(厦门致微仪器有限公司)；CFX96TM实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2细胞处理与分组 在培养条件为37 ℃，5%CO2的细胞培养箱中用完全培养液培养HK-2细胞，选第3～5代细胞，取同步处于G0期的细胞，随机分为7组，分别为对照组(培养基，NC组)、模型组[尿酸(600 μmol·L-1)，UM组]、高尿酸+替米沙坦组[尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1)，UT组]、高尿酸+罗格列酮组[尿酸(600 μmol·L-1)+罗格列酮(10 μmol·L-1)，UR组]、高尿酸+GW9662组[预先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻断剂GW9662 处理30 min，再加入尿酸 (600 μmol·L-1)，UG组]、高尿酸+替米沙坦+GW9662组[预先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻断剂GW9662 处理30 min，再加入尿酸(600 μmol·L-1)+替米沙坦(10 μmol·L-1)，UTG组]和高尿酸+罗格列酮+GW9662组[预先用5000 nmol·L-1PPAR-γ阻断剂GW9662 处理30 min，再加入尿酸(600 μmol·L-1)+罗格列酮(10 μmol·L-1)，URG组]。各组刺激培养48 h后，细胞融合90%～95%。

1.3观察指标与检测方法

1.3.1流式细胞仪检测HK-2细胞hUAT、PPAR-γ蛋白表达 终止培养后收集细胞(1×106)。离心，洗涤，弃上清液，加1：100稀释的鼠抗人hUAT、PPAR-γ蛋白单克隆抗体100 μL；37 ℃水浴，离心，弃上清液，加1：20稀释的羊抗鼠IgG-FITC 100 μL，水浴，离心洗涤，去上清液，除去未结合荧光抗体，调整细胞数为1×106·L-1，上机(FACSCalibur ，BD)检测。实验设正常对照：用磷酸盐缓冲液(PBS)代替1：100稀释的鼠抗人hUAT、PPAR-γ 单抗。阴性对照：只加1：100稀释的鼠抗人hUAT、PPAR-γ单抗而不加IgG-FITC抗体的阴性对照。结果以阳性细胞率表示。

1.3.2流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况 终止培养，将培养基吸出，用PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞(1×106)。离心，弃上清液，用70%冰乙醇沉淀，4 ℃悬浮固定24 h。固定细胞经碘化丙啶综合染料(PI、Rnase、Triton X-100)一步法染色30 min后，300目尼龙筛网滤过，上流式细胞仪检测，检测DNA含量，计数在G1峰前出现的DNA含量下降的亚二倍体峰的细胞数，计算出细胞凋亡率。

1.3.3Q-PCR法检测HK-2细胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表达情况 Trizol法提取总RNA：RNA溶液在-80 ℃条件下保存。取RNA溶液1 μL，用紫外分光光度法于波长260 nm和280 nm处测定吸光度(A值)，A260/A280比值在1.8～2.0。逆转录cDNA：合成后cDNA在-20 ℃或更低温度下保存。荧光定量聚合酶链反应(PCR)反应：通过GenBank查找hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1序列，选取GAPDH作为内参。应用CFX96TM实时荧光定量PCR仪，进行荧光定量PCR。每个样品设2个复孔，取平均扩增循环次数Ct值。以内参GAPDH为对照，计算相对定量ΔCt值。以对照组为对照，计算相对定量ΔΔCt值。采用相对定量2-ΔΔCt法比较三个基因的mRNA的表达差异。2-ΔΔCt代表实验组目的基因相对于对照组的变化倍数。ΔΔCt值=实验组(目的基因Ct值-内参基因Ct值)-对照组(目的基因Ct值-内参基因Ct值)。荧光定量PCR扩增基因引物序列，hUAT(NM_001001290.2)：上游(5′→3′)GACTTCCTAGTGGGTGTGAA，下游(5′→3′)AATGT-CATTTCCACTGAAGC，产物长度225 bp；PPAR-γ(NM_001127330.2)：上游(5′→3′)AGCCAACACTAAACCACA，下游(5′→3′)AGAAACCCTTGCATCCT，产物长度337 bp；COX-2(NM_001124348)：上游(5′→3′)TGAAA-CCCACTCCAAACACA，下游(5′→3′)TGGAACA-ACTGCTCATCACC，产物长度301 bp；MCP-1(NM_011333.3)：上游(5′→3′)AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA，下游(5′→3′)GGTGGTCCATGGAATCCTGA，产物长度103 bp；TGF-β1(NM_011577.2)：上游(5′→3′)AGCG-ACTCGCCAGAGTGGTTA，下游(5′→3′)GCAGT-GTGTTATCCCTGCTGTCA，产物长度130 bp；GAPDH(NM_001289726.1)：上游(5′→3′)CCTTCCG-TGTTCCTAC，下游(5′→3′)GACAACCTGGTCCTCA，产物长度152 bp。

1.3.4Western blotting检测正常及高尿酸条件下HK-2上hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表达 取出相应的实验处理组的培养瓶，弃培养液，用预冷的PBS冲洗2次，按照6孔，板每孔加入裂解液100～200 μL(6 cm培养皿200～300 μL)。充分裂解，取上清液，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。全自动化学发光分析仪中检测，通过TANONGIS软件读取相关条带灰度值。

2 结果

2.1各组HK-2细胞hUAT、PPAR-γ蛋白表达 通过流式细胞仪检测hUAT、PPAR-γ蛋白表达(以阳性细胞率表示)，PPAR-γ抑制剂联合替米沙坦、罗格列酮干预，阳性细胞率上升(P<0.05)，较单用替米沙坦、罗格列酮比例下降(P<0.05)，提示替米沙坦无法逆转PPAR-γ抑制后阳性细胞率减少，替米沙坦有激活PPAR-γ受体作用。见表1。

表1 7组HK-2细胞hUAT、PPAR-γ蛋白阳性细胞率

2.2各组HK-2细胞的凋亡 应用PPAR-γ抑制剂后联合替米沙坦、罗格列酮，凋亡率下降明显(P<0.05)，与单用替米沙坦、罗格列酮比较，凋亡率下降减弱(P<0.05)，提示替米沙坦无法逆转PPAR-γ抑制后所致的凋亡率明显上升。见表2。

表2 7组HK-2细胞凋亡情况

2.3HK-2细胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1的表达 应用PPAR-γ抑制剂联合罗格列酮及替米沙坦，hUAT、PPAR-γmRNA表达增加(P<0.05)，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表达减少，但差异无统计学意义(均P>0.05)，与单用替米沙坦、罗格列酮比较，hUAT、PPAR-γ表达减少，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表达增加(均P<0.05)。提示替米沙坦无法逆转PPAR-γ抑制后所致的hUAT、PPAR-γ表达减少，COX-2、MCP-1、TGF-β1mRNA表达增加。见表3。

表3 7组HK-2细胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表达

Tab.3 HUAT，PPAR-γ，COX-2，MCP-1 and TGF-β1 mRNA levels in seven groups of HK-2 cells

表3 7组HK-2细胞hUAT、PPAR-γ、COX-2、MCP-1、TGF-β1 mRNA的表达

组别hUATPPAR-γCOX-2MCP-1TGF-β1NC组1.00±0.071.00±0.191.00±0.371.00±0.131.00±0.07UM组0.19±0.25①0.17±0.02①3.65±0.9①4.07±0.55①5.35±0.33①UT组0.46±0.01②0.53±0.1②1.82±0.69②2.24±0.45②2.16±1.18②UR组0.46±0.04②0.83±0.13②1.47±0.31②2.51±0.67②1.99±0.67②UG组0.06±0.04①0.25±0.02①3.07±0.93①3.32±0.92①4.57±0.11①UTG组0.31±0.26③⑤0.5±0.02③⑤2.76±0.58③⑤3.2±0.71③⑤3.72±0.64③⑤URG组0.29±0.09④⑤0.38±0.05④⑤2.96±0.43④⑤3.04±0.89④⑤3.09±0.78④⑤F328.33659.3127.6576.69416.056P0.0000.0000.0010.0020.000

①与NC组比较，hUAT：t=-53.525，-421.549；PPAR-γ：t=-56.895，-62.681，COX-2：t=5.235，4.012，MCP-1：t=9.772，4.508，TGF-β1：t=22.846，56.010，P<0.05；②与UM组比较，hUAT：t=10.541，10.548；PPAR-γ：t=7.856，10.583，COX-2：t=-5.139，-5.412，MCP-1：t=-3.167，-5.706，TGF-β1：t=-5.726，-11.917，P<0.05；③与UT组比较，hUAT：t=-5.102；PPAR-γ：t=-3.562，COX-2：t=3.327，MCP-1：t=1.579，TGF-β1：t=4.120，P<0.05；④与UR组比较，hUAT：t=-66.732；PPAR-γ：t=-9.097，COX-2：t=7.431，MCP-1：t=3.036，TGF-β1：t=3.20，P<0.05；⑤与UG组比较，hUAT：t=8.513，16.234；PPAR-γ：t=13.650，7.184，COX-2：t=-3.720，-3.025，MCP-1：t=-3.106，-12.657，TGF-β1：t=-2.275，-3.325，P<0.05。

①Compared with NC group，hUAT：t=-53.525，-421.549；PPAR-γ：t=-56.895，-62.681，COX-2：t=5.235，4.012，MCP-1：t=9.772，4.508，TGF-β1：t=22.846，56.010，P<0.05；②Compared with UM group，hUAT：t=10.541，10.548；PPAR-γ：t=7.856，10.583.COX-2：t=-5.139，-5.412，MCP-1：t=-3.167，-5.706，TGF-β1：t=-5.726，-11.917，P<0.05；③Compared with UT group，hUAT：t=-5.102；PPAR-γ：t=-3.562，COX-2：t=3.327，MCP-1：t=1.579，TGF-β1：t=4.120，P<0.05；④Compared with UR group ，hUAT：t=-66.732；PPAR-γ：t=-9.097，COX-2：t=7.431，MCP-1：t=3.036，TGF-β1：t=3.20，P<0.05.⑤Compared with UG group，hUAT：t=8.513，16.234；PPAR-γ：t=13.650，7.184，COX-2：t=-3.720，-3.025，MCP-1：t=-3.106，-12.657，TGF-β1：t=-2.275，-3.325，P<0.05.

2.4HK-2 hUAT、PPAR-γ 、COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表达 应用PPAR-γ抑制剂联合罗格列酮及替米沙坦发现，hUAT、PPAR-γ蛋白表达增加(P<0.05)，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表达减少(P<0.05)；与单用替米沙坦、罗格列酮比较，hUAT、PPAR-γ蛋白相对表达减少，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白相对表达增加(P<0.05)。提示替米沙坦无法逆转PPAR-γ抑制后所致hUAT、PPAR-γ蛋白表达减少，COX-2、MCP-1、TGF-β1蛋白表达增加。见图1。

1.NC组；2.UM组；3.UT组；4.UR组；5.UG组；6.UTG组；7.URG组。①与NC组比较，P<0.05；②与UM组比较，P<0.05；③与UT组比较，P<0.05；④与UR组比较，P<0.05；⑤与UG组，P<0.05。

3 讨论

3.1尿酸性肾病肾间质纤维化的病理生理机制 尿酸盐刺激肾小管上皮细胞可以通过多种途径介导肾间质纤维化，如上皮细胞转分化[11-13]、自噬[5]、肾小管细胞凋亡[14]等，其中氧化应激反应[4]、内质网应激[12]为主要诱导机制。此外，尿酸盐可破坏肾小管上皮细胞紧密连接蛋白的结构、功能及分布异常，导致肾小管损伤[15]。TGF-β1是致纤维化因子，通过上调MCP-1，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β等的表达[16]，诱导氧化应激反应，影响小管细胞转分化[17-18]，抑制氧化应激，可以减少细胞凋亡[19-20]。COX-2主要产生部位在内质网和核膜，影响前列腺素的分泌，参与内质网应激，产生级联炎症反应[21]，减少炎症及氧化损伤能抑制HK-2细胞凋亡[22-23]。本研究通过单钠盐刺激肾小管上皮细胞模型发现，与正常HK-2细胞比较，模型组细胞凋亡率上升，TGF-β1、COX-2及MCP-1mRNA、蛋白表达明显增强，提示存在肾间质纤维化改变依据。

3.2PPAR-γ表达、病理生理学意义及罗格列酮干预机制 PPAR-γ属II型核受体超家族，与配基(或配体)结合后调节相应基因的转录。生理情况下，集合管强表达，间质细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞弱表达[24]。肾小管上皮细胞PPAR-γ表达活性降低，TGF-β1表达上调诱导氧化应激反应[25-26]，介导细胞凋亡[27]，上调肾组织中PPAR-γ的表达，降低MMP-9和TGF-β1水平，可以起到抗肾间质纤维化的作用[28-30]。此外，激活PPAR-γ受体，可抑制促炎性递质(如IL-6、COX-2、MCP-1)的表达[1，31]。罗格列酮作为PPAR-γ受体激活剂，通过抑制过度的肾脏局部炎症因子MCP-1分泌、抑制TLR/NF-KB信号通路激活、下调趋化因子表达[32-33]，上调肾组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达，发挥肾脏保护作用[16，34]。本研究也观察到UM组PPAR-γmRNA及蛋白表达明显低于UT组，通过罗格列酮干预后，PPAR-γmRNA及蛋白表达上调，而应用PPAR-γ抑制剂后联合罗格列酮治疗，比较单用罗格列酮，PPAR-γmRNA及蛋白表达上调仍然偏低，提示单钠盐刺激HK-2细胞能下调PPAR-γmRNA及蛋白表达，罗格列酮具有激活PPAR-γ受体作用。本项目是基于PPAR-γ受体通路进行研究，而罗格列酮具有明确PPAR-γ受体激活作用，因此，选择罗格列酮干预治疗作为阳性对照进行观察，如能证明替米沙坦有相似或优于罗格列酮的作用，则能进一步证实替米沙坦具有PPAR-γ受体激活机制。

3.3替米沙坦干预尿酸性肾病PPAR-γ表达立项依据 血管紧张素能下调PPAR-γ表达，血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockers，ARB)能抑制这种作用[7]，而且可以减轻HK-2细胞的凋亡和自噬[35]。早有研究表明，替米沙坦能够部分激活PPAR-γ受体[36]，这种作用不依赖血管紧张素II受体阻滞作用，临床及实验研究发现能上调组织中PPAR-γmRNA及蛋白表达，对心梗后心力衰竭、肥胖相关肾病及5/6肾切除大鼠有保护作用[9，37-38]。在尿酸性肾病研究中，可以预防或恢复尿酸所致NADPH氧化酶/ERK1/2/ET-1途径的肾小管损伤，并作为尿酸诱导肾纤维化的有前途的治疗药物试验证据[39]。陈艳梅等[10]通过动物及细胞研究发现，替米沙坦可以调节hUAT蛋白表达，发挥肾脏保护作用。但替米沙坦这种降尿酸、肾脏保护作用是否是通过PPAR-γ途径来实现，其具体机制如何？笔者目前还没有见到相关报道，因此展开此项目研究，进一步完善替米沙坦对尿酸性肾病的肾脏保护机制。

3.4项目研究的意义 本研究建立尿酸盐刺激肾小管上皮细胞模型发现，肾小管上皮细胞表达PPAR-γ减少，罗格列酮、替米沙坦均能上调PPAR-γ表达，抑制PPAR-γ受体后给予罗格列酮、替米沙坦干预，并不能逆转PPAR-γ减少，因此论证替米沙坦具有罗格列酮相似激活PPAR-γ受体作用。进一步对TGF-β1、MCP-1、COX-2、hUAT蛋白表达及凋亡率研究发现，替米沙坦不能逆转PPAR-γ受体抑制后TGF-β1、MCP-1、COX-2表达及凋亡率上升，不能使hUAT蛋白表达的减少。因此得出结论，替米沙坦具有类似罗格列酮激活PPAR-γ受体机制，可能通过PPAR-γ途径调节肾小管细胞凋亡、减少氧化应激及改善间质纤维化而起到肾脏保护作用。