耐药性颞叶癫痫大鼠认知和焦虑及抑郁行为学变化及意义

张淑敏 石涌霏 王丽琨 任思颖 伍国锋

癫痫是由神经元异常放电引起的一种常见的神经系统功能紊乱综合征[1]，其中颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy，TLE)是发病率最高的类型，极易转变为耐药性癫痫或称难治性癫痫[2]，表现为不受药物控制的长期反复的顽固性癫痫发作[3]。除反复痫性发作外，部分患者可能出现执行能力减退、学习记忆障碍、智力下降等认知行为改变[4]，且这类患者自残行为和自杀意念发生率也普遍较高[5]。癫痫发作的不可预测性对患者造成严重危害，其合并症亦可能对癫痫患者的生存质量产生更大影响[6]。因此，不仅要关注癫痫患者临床症状的改善，更需重视癫痫相关合并症的研究与治疗。目前，国内对TLE的系统性行为学研究较少，部分研究只对慢性期癫痫进行探讨，尚未对癫痫的耐药性与否做出细分。该研究通过构建TLE大鼠模型，观察耐药性癫痫大鼠的认知、焦虑、抑郁等行为学改变，旨在为探究耐药性TLE对认知功能及焦虑、抑郁情绪障碍的影响提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物SPF级成年健康雄性SD大鼠80只，体重180～220 g，贵州医科大学实验动物中心购入。自然光照，自由进食水。

1.2 主要试剂及仪器包括：氯化锂、盐酸毛果芸香碱(美国Sigma)，硫酸阿托品(哈尔滨三精药业)，苯巴比妥钠(大连亿德瑞公司)，苯妥英钠(Aladdin，上海)，水合氯醛(科密欧，天津)，SuperMaze行为学分析软件(欣软，上海)，视频监控系统(HIKVISION，杭州)。

1.3 方法

1.3.1癫痫模型制备和分组：随机抽取6只作为正常对照组，其余74只按文献[7]方法制备癫痫模型。预先给予大鼠腹腔注射氯化锂(127 mg/kg)，18～20 h后正式造模，造模前30 min，腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg。采用小剂量多次腹腔注射毛果芸香碱，首次剂量10 mg/kg，后每隔30 min按相同剂量追加，总量不超60 mg/kg，直至大鼠出现Racine分级标准中Ⅳ级及以上的持续性大发作，即癫痫持续状态(status epilepticus，SE)，SE持续60 min后给予水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射终止发作。正常组给予等量生理盐水腹腔注射。2周后大鼠癫痫进入慢性期，出现慢性自发性癫痫发作(spontaneously recurrent seizures，SRS)者即为慢性癫痫大鼠[8]。慢性期开始对大鼠进行24 h视频监控，记录大鼠SRS的次数、癫痫发作等级(Racine分级)及持续时间。2周结束后，出现SRS的大鼠给予腹腔注射苯巴比妥(25 mg/kg，1次/d)，治疗14 d记录发作情况。若治疗后发作次数及持续时间降低50%以上，则判断为对苯巴比妥治疗敏感；若发作次数及持续时间降低少于50%，则继续给予苯妥英钠(75 mg/kg，1次/d，×14 d)治疗，若发作次数及持续时间降低仍少于50%，则视为对两种药物耐药，归为耐药大鼠，反之为药敏大鼠[9]。

共诱发SE大鼠55只(74.32%)，SE后存活28只(50.91%)，发生SRS大鼠24只，药物筛选过程中死亡3只，最终耐药大鼠6只，药敏大鼠15只。将6只耐药大鼠纳入耐药组，从药敏大鼠中随机抽取6只纳入药敏组。

1.3.2旷场实验：方形敞箱，底部等分成25个方格，中间9格为中央区。将大鼠从中心位置放入箱内，自由活动5 min，记录大鼠在各区域的活动情况及站立、理毛、排便等行为。

1.3.3糖水偏好实验：每笼大鼠给予2瓶纯水，自由进食水；第2天将一瓶纯水替换为1%(质量浓度)蔗糖溶液；第3天，禁食水24 h；第4天，给每只大鼠放置等量纯水和1%(质量浓度)蔗糖溶液，隔12 h交换两瓶位置，24 h后计算糖水偏好率。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

1.3.4强迫游泳实验：透明圆柱形桶中注水，深度约30 cm，水温22～26℃。将大鼠放入水中适应训练15 min，训练完毕捞出吹干。24 h后，相同水深和温度，将大鼠放入水中强迫游泳6 min，记录5 min内大鼠在水中的不动时间。

1.3.5Morris水迷宫实验：圆形水池分为4个象限，逃生平台固定于其中一个象限。前4 d，每天将大鼠依次从4个象限放入水中，记录120 s内站上逃生平台所用时间(即逃避潜伏期)。若找到平台，让其停留15 s；未找到平台，用木棒引导至平台并停留15 s。第5天，撤除平台，将大鼠从距原平台最远的象限放入水中，记录120 s内大鼠穿越原平台区域次数、进入目标象限(即原平台所在象限)次数及在目标象限的停留时间。

1.4 统计学处理采用SPSS 25.0软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两均数间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，采用Kruskal-Wallis秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癫痫大鼠行为学变化耐药组大鼠癫痫发作次数、发作等级及持续时间均高于药敏组(P<0.05)。结果见表1。

表1 两组SRS大鼠癫痫发作情况比较

2.2 各组大鼠抑郁样行为改变与正常对照组比较，药敏组和耐药组大鼠强迫游泳实验不动时间长，糖水偏好率降低(均P<0.05)；与药敏组比较，耐药组大鼠强迫游泳实验不动时间长，糖水偏好率低(均P<0.05)。结果见表2。

表2 各组SRS大鼠强迫游泳实验不动时间和糖水偏好率比较

2.3 各组大鼠焦虑样行为改变与正常对照组比较，耐药组和药敏组大鼠总运动距离增加，站立次数减少(均P<0.05)；与药敏组比较，耐药组总运动距离更长，站立次数更少(均P<0.05)。耐药组理毛次数多于药敏组和正常对照组(P<0.05)，而药敏组理毛次数与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)。各组间进入中心区域次数比较无统计学差异(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组SRS大鼠旷场实验焦虑样行为比较

2.4 各组大鼠认知功能改变Morris水迷宫实验结果显示，与正常对照组相比，药敏组第3、4天逃避潜伏期延长(均P<0.05)，而耐药组第1～4天逃避潜伏期均增加(均P<0.05)；与药敏组比较，耐药组第2～4天逃避潜伏期更长(均P<0.05)。在学习记忆测试中，耐药组同样表现出较正常对照组记忆功能更差、穿越原平台区域次数和进入目标象限次数减少、停留时间缩短表现(均P<0.05)。结果见表4～5。

表4 各组SRS大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期比较

表5 各组SRS大鼠Morris水迷宫实验学习记忆功能比较

3 讨论

氯化锂-毛果芸香碱制备癫痫模型可模拟人类TLE的神经病变与行为学改变[7]。该研究结果显示，癫痫大鼠在旷场实验中总运动距离增加，耐药性癫痫大鼠自主活动性明显亢进，这种运动性躁动可能与癫痫发作过程中大脑谷氨酸等兴奋性神经递质增加导致神经兴奋性增强有关[10]；耐药组站立次数、进入中央区域次数减少及理毛次数增加，反映耐药性癫痫大鼠探索性减弱及对空旷区域的紧张情绪增加，焦虑行为增强；强迫游泳实验中耐药组不动时间明显延长，表现出放弃挣扎的绝望行为，提示抑郁程度更重。啮齿类动物偏爱甜食，正常大鼠在纯水和糖水中优先选择喝糖水，而抑郁啮齿类动物优先选择糖水的欲望较低。该研究结果显示，耐药组大鼠的糖水消耗量减少，糖水偏好率降低，提示耐药性癫痫大鼠的快感缺失加重，抑郁样情绪更明显。Morris水迷宫实验中，耐药性癫痫大鼠的学习和空间记忆能力较正常和药敏大鼠明显下降；各组大鼠逃避潜伏期均呈逐渐下降，但耐药组大鼠下降高于其他两组，需要更长的时间进行学习记忆，提示其认知功能减弱；撤去平台后，耐药组大鼠穿过平台区域、进入目标象限次数及停留时间也明显低于正常组和药敏组，表明耐药性癫痫大鼠对平台所在位置的空间记忆能力下降。空间记忆能力主要是海马依赖的记忆形式，海马长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)是学习记忆的生理基础[11]，这种功能的受损很可能与耐药性癫痫发展过程中海马神经元丢失和LTP、LTD异常改变密切相关[12]。部分研究认为，抗癫痫药物的使用可能会产生对认知功能的负面作用，多种抗癫痫药物联合使用会对认知功能产生更大的负面影响[13]，但也有研究表明，在中位有效剂量下，这两种抗癫痫药物的使用并不会对小鼠逃避潜伏期产生影响[14]。该研究结果显示，耐药组大鼠水迷宫实验中的各指标表现均差于药敏组，一定程度上表明耐药性癫痫可导致大鼠认知功能受损加重。耐药性癫痫的形成机制复杂，易并发认知障碍、情绪异常等多种合并症，且对情绪、认知功能的损伤更重，这些合并症与耐药性癫痫之间可能具有双向的生物学联系或某些共同的因果机制，确切结果有待进一步研究。

综上所述，该研究结果显示，慢性癫痫会导致大鼠出现认知功能减退及产生焦虑、抑郁情绪等行为学改变，耐药性癫痫可使认知功能受损、焦虑、抑郁程度加重。提高耐药性癫痫合并症的认识及深入研究耐药性癫痫与其合并症的共患病机制具有一定重要意义。