蒜头果蛋白对HeLa细胞体外抗肿瘤活性及稳定性研究

袁 燕，李艳红，段先乐，唐永研

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650504；2.云南省阜外心血管病医院，云南 昆明 650102)

蒜头果(MalaniaoleiferaChun et S. Lee ex S. Lee)是铁青树科、蒜头果属常绿乔木[1]，分布于中国广西西部龙州、大新和右江流域各县及云南东部广南、富宁等地[2]，是广西省和云南省特有的重点保护植物[3-4].蒜头果是一种特殊的石山地区绿化树种，本身就具有较高的价值，为滇东南和桂西石山绿化树种[5].蒜头果为单种属稀有植物[6]，形态解剖特征既有原始性状，又有进化特征，对于研究铁青树科的分类系统有一定的意义[7].蒜头果种仁中含油率非常高，高达52%～67%[8]，其主要脂肪酸廿四碳-(15)-烯酸可制得麝香酮(十五内酯)[9-10]，具有非常高的经济开发价值[11].

由于蒜头果是云南省和广西省特有的濒危植物，所以国外无资源也无相关研究.国内目前主要是从蒜头果的育苗技术和保护、营林特性、种质资源和濒危机制及蒜头果油的开发利用等方面研究的比较多[12-15]，但从蒜头果种子中分离纯化蛋白质并进行抗肿瘤活性及作用机制等方面的研究尚未见报道.

本研究将蒜头果种子去壳、捣碎、纱布过滤、离心、上清液用(NH4)2SO4沉淀并过疏水色谱层析柱，得到Malanin，采用MTT法测定其对HeLa细胞体外抗肿瘤活性并测定其与DDP联合用药的效果，探索Malanin的稳定性及贮存方式，为该蛋白在肿瘤治疗方面的开发利用打下基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒜头果种子购于云南省种子公司；HeLa细胞由云南大学生命科学院提供；胰蛋白酶为华美产品；四甲基偶氮唑盐[MTT]为Biom公司产品；DMEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；顺铂(DDP)为北京伊塔生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯.

1.2 主要仪器设备

蛋白纯化系统(Amersham)；二氧化碳培养箱(SANYO)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；离心机(Eppendorf)；超净工作台(苏净集团安泰公司)；酶标仪(TECAN Sunrise).

1.3 实验方法

1.3.1 蒜头果蛋白样品的制备

将蒜头果种子去外壳和种皮，用高速组织捣碎机，4 ℃ 冷库中抽提 2 h 后用4层纱布过滤，离心 30 min(8 000 r/min, 4 ℃)，弃沉淀.上清液用30%～100%硫酸铵分级沉淀，低温离心 30 min (8 000 r/min, 4 ℃)，沉淀用 20 mmol/L pH 7.4 PBS(磷酸盐)和 2.5 mol/L 硫酸铵缓冲液溶解和上样，于GE AKTA Pure 100蛋白质纯化系统上疏水色谱层析柱HiprepTM phenyl FF (High sub, 20 mL)，用0%～100% ddH2O(去离子水)按线性梯度洗脱，在 280 nm 下进行检测，5 mL 每管自动收集[16].结果用15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，收集目标样品用真空冷冻干燥机冻成干粉后备用[17].

1.3.2 HeLa细胞培养

无菌条件下将胎牛血清加入至DMEM培养液(pH 7.2)中，使其终浓度为10%，混匀后备用.将HeLa细胞接种于DMEM培养液(含10%胎牛血清)中，于二氧化碳培养箱(5% CO2、37 ℃)中培养，约2～3 d 传代1次，取对数生长期的HeLa细胞用于后续实验[18].

1.3.3 蒜头果蛋白与HeLa细胞作用浓度初筛

将1.3.2培养的HeLa细胞用胰酶消化后，用计数板进行计数，按1.0×105个/mL细胞浓度接种于96孔细胞培养板中，每孔 100 μL，在二氧化碳培养箱(5%CO2、37 ℃)中培养 1 d 后更换培养基.将 1 mg/mL 蒜头果蛋白溶液按10倍逐步稀释，得到6个不同浓度的蒜头果蛋白样品，将此样品分别加入至96孔培养板中，每孔 20 μL，6个平行复孔，继续培养 3 d 后于倒置显微镜下观察结果[19]，预估蒜头果蛋白与HeLa细胞作用的最佳浓度.

1.3.4 蒜头果蛋白体外抑制HeLa细胞活性的测定

取1.3.2培养的HeLa细胞，用0.25%胰酶消化，计数板计数，以1.0×105个/mL细胞浓度接种于96孔细胞培养板中，每孔 100 μL，在CO2培养箱(5%CO2、37 ℃)中培养 1 d，更换DMEM培养液后，每孔加入 20 μL 不同浓度的蒜头果蛋白样品，设6个平行复孔，继续培养 72 h 后弃上清，加入 20 μL 新配制的MTT溶液(5 g/L)，继续培养，4 h 后去上清，每孔加入DMSO (二甲基亚砜) 150 μL，置于微量搅拌器上振荡 30 min，在 570 nm 波长下测定其OD值，用于定量反映细胞的活性状态[20].用广谱抗癌药物顺铂(DDP)作为阳性对照[21]；以有细胞而不加蛋白的孔为阴性对照；以不加细胞和培养基，只加MTT和DMSO的孔为空白对照，计算抑制率.

(1)

以蒜头果蛋白不同质量浓度的负对数(-lgρ)作为横坐标，抑制率IC%为纵坐标，作线性回归方程，计算蒜头果蛋白和顺铂作用 72 h 的半数抑制质量浓度，即IC50值[22].

1.3.5 蒜头果蛋白与顺铂联合用药的药效测定

1.3.6 蒜头果蛋白稳定性研究

1) 蒜头果蛋白在不同保存方式下的稳定性

根据1.3.4的方法，测定 0.5 mg/mL 蒜头果蛋白溶液在不同保存方式下与HeLa细胞作用 72 h 的IC50值，分析其对HeLa细胞体外生长的抑制率.

2) 蒜头果蛋白在不同温度处理下的稳定性

分别将 0.5 mg/mL 蒜头果蛋白溶液于20、30、40、50、60、70、80、90和 100 ℃ 的水浴锅中温浴 2 h，4 ℃ 表示 0.5 mg/mL 蒜头果蛋白样品贮于 4 ℃ 冰箱中，按1.3.4的方法计算在不同温浴条件下蒜头果蛋白溶液对HeLa细胞作用 72 h 的抑制率.

2 结果与分析

2.1 蒜头果蛋白样品的制备

蒜头果蛋白纯化的色谱层析如图1所示，共得到4个组份(I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，其中组份Ⅳ即为蒜头果蛋白样品，收集，备用.

图1 蒜头果蛋白分离纯化色谱层析图

2.2 蒜头果蛋白与HeLa细胞定性分析

蒜头果蛋白与HeLa细胞作用 72 h 后的细胞状态如图2所示.图2 a(空白对照)中HeLa细胞贴着瓶壁呈单层紧密排列、胞体饱满、互相交织呈簇状生长；待蒜头果蛋白与HeLa细胞作用 72 h 后，明显发现HeLa细胞外型皱缩、圆化、体积变小、排列松散或聚集成团，部分细胞从壁上脱落悬浮在培养基中，继而发生崩解，破裂成碎片(如图2 b)，说明蒜头果蛋白具有抑制HeLa细胞体外生长的作用.

图2 HeLa细胞形态学观察(20×)

2.3 蒜头果蛋白对HeLa细胞体外抗肿瘤活性测定

MTT比色法测定结果表明，不同浓度的蒜头果蛋白和顺铂对HeLa细胞均具有明显的抑制作用，且随着质量浓度的增大和作用时间的延长，蒜头果蛋白和顺铂对HeLa细胞的抑制率明显增大，具有剂量和时效依赖性.

以蒜头果蛋白不同质量浓度的负对数(-lgρ)作为横坐标，根据公式1计算的抑制率IC%为纵坐标，其线性回归方程如图3所示，计算得到蒜头果蛋白Malanin和顺铂与HeLa细胞作用DDP 72 h 的半数抑制浓度(IC50值)分别为9.55×10-6、4.76×10-4g/L.由此可见，蒜头果蛋白的IC50值明显小于广谱抗癌药物顺铂，表明蒜头果蛋白具有非常强的抗肿瘤活性.

图3 不同浓度蒜头果蛋白和顺铂对HeLa细胞的抑制率

2.4 蒜头果蛋白与顺铂联合应用的药效测定

蒜头果蛋白(M)、顺铂(D)、蒜头果蛋白和顺铂联用(M+D)对HeLa细胞的抑制率曲线如图4.结果表明，三者的抑制率曲线随着时间的延长都逐渐升高，表现出很好抑制效果，说明均具有抑制HeLa细胞体外生长的作用.蒜头果蛋白和顺铂联用对HeLa细胞的抑制率曲线均高于蒜头果蛋白和顺铂单独与HeLa细胞作用的抑制率曲线，说明蒜头果蛋白和顺铂联合应用具有协同抑制HeLa细胞体外生长的作用，二者联合应用的药效会增加.

图4 蒜头果蛋白、顺铂和两药联用与HeLa细胞作用不同时间的抑制率

此外，根据金氏公式计算得出等于0.95，大于0.85而小于1.15，表示二者联用效应相加(+)，说明蒜头果蛋白和顺铂联合应用对HeLa细胞具有协同抑制效应.

2.4 蒜头果蛋白稳定性研究

2.4.1 不同保存方式的蒜头果蛋白对HeLa细胞的稳定性

用MTT比色法测定了蒜头果蛋白样品在不同保存方式下与HeLa细胞作用 72 h 的抑制率，其IC50值见表1.刚从层析柱上分离纯化的蒜头果蛋白溶液立即进行HeLa细胞活性测定，其IC50值最小(3.65×10-6mg/mL)，对HeLa细胞的抑制率最高，说明活性最好.如果将此样品溶液用真空冷冻干燥机冻成干粉、置于 -20 ℃ 冰箱中保存6个月和12个月，测定此3个样品对HeLa细胞的活性，发现其活性与刚从层析柱上分离纯化的蒜头果蛋白溶液相差不大，分别为3.98×10-6、3.99×10-6和4.12×10-6mg/mL，说明蒜头果蛋白干粉于 -20 ℃ 冰箱中保存12个月后其活性仍然很好.但如果不冻成干粉，直接将此溶液于 -20 ℃ 冰箱中保存12个月，其活性则下降了2倍多；如将此溶液反复冻、融3次，其活性则急剧下降，比原溶液活性降低了近42倍.此结果表明，贮存蒜头果蛋白样品最好是将其真空冷冻干燥成干粉，并分装成小瓶于 -20 ℃ 冰箱中保存，一定要避免反复冻融.

表1 蒜头果蛋白在不同保存方式下对HeLa细胞IC50的比较

2.4.2 不同温度下处理的蒜头果蛋白对HeLa细胞的稳定性

用水浴锅在不同温度下处理的蒜头果蛋白溶液对HeLa细胞的抑制率如图5.在 4 ℃ 冰箱中保存的蒜头果蛋白溶液与HeLa细胞作用 72 h 的抑制率高达91.7%；在 50 ℃ 水浴中处理 2 h 后，对HeLa细胞的抑制率还有57.7%；只有温度高达 80 ℃ 时，蒜头果蛋白变性才比较彻底，几乎完全失活，抑制率只有9.4%.说明蒜头果蛋白的热稳定性较好，非常便于在冰箱中保存.

图5 不同温度处理的蒜头果蛋白对HeLa细胞的抑制率

3 结语

蒜头果蛋白是从云南省和广西省特有植物—蒜头果种子中分离纯化出来的一种新的蛋白质，该蛋白的物理化学性质、结构及功能都在不断的探索中.本文采用MTT法分析蒜头果蛋白对HeLa细胞体外增殖的影响.结果表明，蒜头果蛋白对HeLa细胞具有明显的抑制作用，其IC50值非常小，为 9.55×10-6g/L，明显比广谱抗癌药物顺铂(IC50值为 4.76×10-4g/L)的抗肿瘤活性强；且它与顺铂联合应用具有协同抑制效应；其稳定性也很好，非常便于冰箱中保存.本课题组进一步研究还发现，蒜头果蛋白还能诱导HeLa细胞发生凋亡，可以俘获S期的HeLa细胞，使DNA不能正常的复制，从而导致细胞的增殖、生长受到抑制.其体内抗肿瘤活性及抗癌作用机制还在进一步研究中.