思茅藤不同极性部分化学成分分析及其免疫抑制活性

程桂广，张 静，杨美莲，李俊华，陈 婷，赵天瑞，曹建新，开国银

(1.昆明理工大学 食品科学与工程学院，云南 昆明 650500;2.云南西草生物科技开发有限公司，云南 昆明 650500;3.浙江中医药大学 药学院,浙江 杭州 310053)

免疫系统是机体执行免疫应答和免疫功能、抵御病原菌侵害的重要系统.它通过识别抗原而做出免疫应答来维持机体的稳态[1].淋巴细胞作为最重要的免疫细胞可分为T和B淋巴细胞.T淋巴细胞表面抗原主要是MHC抗原和CD分子，机体发生免疫应答时其通过分泌各类炎症因子，辅助B细胞增殖分化成抗体，参与体液免疫，共同维持内环境的稳定[2].然而T或B淋巴细胞的过度活化会导致一系列的自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮等.目前临床上常用的免疫抑制药物主要有糖皮质激素类免疫抑制药物、化学免疫抑制药物如硫唑嘌呤、环磷酰胺、来氟米特和甲氨蝶呤等一些来自真菌代谢产物的免疫抑制药物如他克莫司、环孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸酯、咪唑立宾，以及从中草药中提取的免疫抑制药物如FTY720(冬虫夏草的有效成分ISP-1经化学修饰改造后的产物)和雷公藤等[3].但大多数的该类免疫抑制剂由于严重的副作用及对机体的有一定的耐药性因而不能广泛的应用于临床.因此，从天然产物中开发并寻找安全有效的免疫抑制药物显得尤为重要.

思茅藤属(Epigynum)是夹竹桃科夹竹桃亚科(Apocynoideae)思茅藤族(Epigyneae)的一个属.据记载，该属植物大约有14个种，分布于马来西亚和缅甸等热带地区，在中国只有思茅藤(Epigynumauritum)一种，产于云南南部西双版纳和景洪等地.思茅藤是傣族作为清热、解毒和消肿止痛的民间用药植物，其树皮主要用于治疗跌打损伤、肢体关节痛及颈腰椎病等[4].关于思茅藤的植物化学研究表明，该植物富含结构多样的甾体类化合物，且大多数具体较好的免疫抑制活性[5-8].其中Epigynosides E、Epigynosides F和Epigynosides G在 50 μmol/L 时的免疫抑制效果与地塞米松相当[9].为了更好的开发和利用植物资源，从思茅藤植物中寻找有效的活性物质，文中通过D101大孔吸附树脂对思茅藤提取物进行不同极性部分划分，并利用超高效液相色谱-质谱联用仪(UHPLC-MS/MS)对其进行主要化学成分分析，结合免疫抑制活性结果，确定最佳活性部位，并考察对细胞因子分泌和细胞周期变化的情况，为进一步开发高效的活性物质提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000超高效液相色谱仪(Thermo Scientific公司，美国)；乙腈、甲醇(质谱纯，Merck公司，德国)；甲酸(色谱纯，Sigma-Aldrich公司)；超纯水用Milli-Q系统制备(Millipore，美国)；SpectraMax M5 酶标仪(Molecular Devices公司，美国)；SB5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)(Sigma公司，美国)；CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠ELISA测定试剂盒(IL-6，TNF-α)(杭州联科生物技术股份有限公司)；小鼠淋巴细胞分离液(北京达科为生物技术有限公司)；胎牛血清和RPMI培养基(HyClone公司，美国)；细胞周期检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司).

1.2 思茅藤粗提物及不同极性混合物制备

思茅藤样品于2018年4月采自云南普洱，经昆明理工大学曹建新教授鉴定并保存于昆明理工大学农业与食品学院功能食品实验室(凭证标本：Cheng20180412-01).思茅藤地上部分经自然晾干后粉碎，称取一定量的干燥粉状样品用70%乙醇水(料液比为1∶10)进行超声辅助提取3次，每次提取 30 min.收集提取液，经 4 000 g 离心 10 min 后合并提取液上清部分，在 50 ℃ 下用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，得到思茅藤提取物浸膏.经冷冻浓缩机冻干后得到思茅藤乙醇粗提取物(CE).

参照文献[10]的方法，CE通过D101型大孔吸附树脂进行极性段划分.D101型大孔树脂用乙醇浸泡过夜进行活化，用蒸馏水清洗树脂至无醇味后备用.将树脂装好柱后浸膏用蒸馏水完全溶解后上样，待样品吸附完全后，进行梯度洗脱.流动相依次为 MeOH∶H2O(0∶100，20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0，V/V)，每个梯度清洗5个柱体积，洗脱完全后合并各极性部分的样品，经浓缩后得到6个组分样品，分别为：Fr.0%，20%，40%，60%，80%和100%，并保存于 4 ℃ 下备用.

1.3 思茅藤各极性部分主要化学成分分析

将上述得到的思茅藤粗提物及不同极性部分混合物用质谱级甲醇完全溶解后，过 0.22 μmol/L 的有机膜，使用安捷伦C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)通过超高效液相色谱-质谱联用仪进行化学组成分析.其中液相分离条件为：柱温 35 ℃，进样量 2 μL，流速 0.2 mL/min.流动相为0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序为0～5 min，10%～15% B；5～10 min，5%～20% B；10～20 min，20%～40% B；20～25 min，40%～60% B；25～27 min，60% B；27～33 min，10%～60% B.质谱条件：负离子模式，质谱扫描范围为m/z100～1 000，分辨率 70 000，毛细管温度 320 ℃，电压 3.3 kV，鞘气流速 32 L/min，辅助气流流速 8 L/min.

1.4 免疫抑制活性实验

SPF级雄性BALB/c小鼠，体重18～24 g，购自昆明医科大学实验动物学部(证号编号：SYXK, 2011-0004)，饲养在(23±2)℃、湿度50%～60%的SPF级动物饲养房中.

1.4.1 免疫抑制指数的测定

参照文献[11]的方法，将BALB/c小鼠经安乐死后，放入无菌超净工作台中，进行大体解剖.取出小鼠脾脏置于预冷的PBS中，轻轻晃动清洗除去脂肪及结缔组织.转移脾脏至RPMI不完全培养基中通过0.075 0 mm目不锈钢过滤筛网进行研磨得到细胞，并进行2次过滤除去多余组织.将细胞转移至离心管中轻轻吹散开，并于 1 000 r/min 下离心 5 min 得到细胞沉淀，加入 3 mL 的红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)裂解细胞，裂解完全后用预冷的PBS清洗2遍即得脾细胞.用完全培养基调整细胞密度至1×106个/mL，并按照如下方法进行实验：

空白组 120 μL RPMI完全培养基；

阴性对照组 100 μL 脾细胞悬液+20 μL RPMI完全培养基；

模型组 100 μL 脾细胞悬液+10 μL Con A +10 μL RPMI完全培养基；

样品组 100 μL 脾细胞悬液+10 μL Con A +10 μL 不同浓度样品.

每组5个复孔，于 37 ℃，5% CO2培养箱内培养 48 h.用CCK-8法测细胞的增殖情况，使用酶标仪在 450 nm 处检测各孔OD值，并按照以下公式进行刺激指数值(SI)的计算：

B淋巴细胞抑制实验将Con A(终质量浓度为 10 μg/mL)换成LPS(终质量浓度为 20 μg/mL)，重复上述步骤即可.

1.4.2 细胞因子IL-6和TNF-α的测定

按照上述2.3.1的方法制备得到脾细胞后，调整细胞密度至1×106/mL，并将其培养至24孔板中，按照上述方法进行加样并培养 48 h 后，10 000 r/min 离心 5 min 得到细胞培养上清液.按照ELISA测定试剂盒说明书的方法测定IL-6和TNF-α的含量.

1.4.3 细胞周期分布情况的测定

碘化丙啶(Propidium，PI)可染色细胞中的双链DNA，产生荧光，且荧光的强度与双链DNA的含量呈正相关，当细胞内的双链DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定，然后根据DNA含量的分布情况，进行细胞周期分布分析.本研究参照之前的报道方法使用流式细胞仪对细胞周期分布情况进行测定[12].具体实验操作步骤如下：

按照上述2.3.1的方法将细胞培养在6孔板中，培养 48 h 后，小心吸取细胞至离心管中，经离心得到细胞沉淀，用预冷的PBS清洗2遍后，用少量的PBS重悬细胞.将 2 mL 预冷的75%乙醇溶液中逐滴加入上述的细胞悬液(冰上操作)，并轻轻吹打细胞使其分散均匀，于 4 ℃ 固定过夜.固定好后离心除去乙醇，并用PBS再次清洗细胞.参照细胞周期测定试剂盒的方法，使用流式细胞仪对细胞周期分布情况进行测定.

1.5 数据处理及统计分析

实验数据均采用“平均数±标准差(Mean±SD)”表示(n=3)，对实验组的数据进行多重比较的t检验，显著性水平设定为p<0.05.绘图和数理统计等使用Origin 8.5软件处理.

2 结果与讨论

2.1 思茅藤不同极性部分主要化学成分分析

UHPLC-MS/MS对思茅藤提取物及不同极性部分中的化学成分进行分析，其总离子流图见图1.通过与Massbank数据库、标准品以及相关文献报道的一级和多级质谱数据比对思茅藤提取物主要化学成分进行指认，鉴定结果如表1所示.共鉴定出24个化合物，包括6个多酚，5个黄酮、11个甾体化合物和2个其他类型化合物.

图1 思茅藤粗提物和不同极性部分提取物液质分析总离子流图

表1 思茅藤粗提物及不同极性部分主要化学成分

高速逆流色谱法、模拟移动床(SMB)色谱、衍生化技术、硅胶柱层析法等在植物甾醇和黄酮类化合物等非极性或弱极性物质的分离和制备中有较广泛的应用[13].但由于实验条件、设备要求高以及资源浪费等问题，很难实现高效分离及工业化应用.大孔树脂作为色谱法的吸附介质，耐酸耐碱性好，稳定性好，可再生后可重复使用，在甾体类化合物的分离纯化中有较为广泛的应用.从思茅藤粗提物(CE)的总离子流中发现思茅藤提取物除了含较多小分子酸以外，化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione)有较高的峰面积，为该植物的主要化学成分.而经D101大孔树脂进行极性段划分后，不同极性部分提取物含有的化合物种类有较大的差异(表1).Fr.0%部分含有以葡萄糖酸等小分子酸为主的少量化合物.而Fr.20%～40%段化合物含有较多的多酚、黄酮等酚类化合物，其中Fr.20%部分的主要化成成分为绿原酸(5)，其显示出最大的峰面积.Fr.60%和80%部分富含较多的木犀草苷、山奈酚及其他的一些酚类物质.此外，Fr.80%段提取物还富含以Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione(16)为主的甾体类化合物.而Fr.100%部分极性较小，富含的化合物以均以雄甾烷及其衍生物为主.

雄甾烷类化合物缺少统一的裂解规律，一般以丢失甲基、水分子为主，其他裂解必须涉及母核断裂.而含糖苷的孕甾烷类化合物主要是糖苷的丢失，以及失去五元环的3个碳原子和C17的侧链，最多还能再失去1个H原子.以化合物15(Epigycoisde B，孕甾烷)和化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione，雄甾烷)为例，在化合物15中，2个糖苷的断裂，分别得到m/z145.029 2 和 177.064 4 的碎片，在进一步电子的轰击下会造成母核的断裂，得到m/z303.049 4 的二级碎片.由于碳碳双键容易质子化，化合物16中，4位和8位上的双键经过质子化后会造成母核的断裂，主要得到m/z211.111 7 和m/z192.093 0 离子片段.除了带糖苷的孕甾烷由于糖苷键的断裂易得到糖苷片段以外，雄甾烷和孕甾烷均没有固定的裂解规律，只能通过判断某些母核的断裂情况以及糖苷的质谱结果去确定其部分结构，却很难通过液质进行准确的定性分析[14]，因此化合物17～19和21均被鉴定为雄甾烷衍生物.

2.2 思茅藤提取物对脾细胞的增殖抑制活性

T和B淋巴细胞表面存在可以识别抗原的受体，当受到特异性抗原刺激时，均会发生增殖现象.刀豆蛋白 A(Concanavalin A, Con A)能够促进T淋巴细胞产生细胞因子并且作为一种有丝分裂原能够选择性的激活T淋巴细胞增殖[15-16]；脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)则是一种可选择性激活B细胞增殖的有丝分裂原，能够促进B 淋巴细胞增殖并促使其产生抗体[17].因此，本研究根据这2种有丝分裂原的特异性，参照之前的方法建立脾细胞增殖抑制实验模型，检测思茅藤及不同极性部分提取物对其的影响，评价思茅藤不同极性部分提取物的免疫抑制活性.

刺激指数(SI)是评价细胞增殖活性的一个指标，SI的高低反映了T/B淋巴细胞增殖率的高低[18].结果如图2和3所示，经Con A或LPS刺激后小鼠脾细胞均出现不同程度的增殖反应，其SI值均大于4(空白组为1).而思茅藤粗提物及不同极性部分化合物均能够不同程度地抑制Con A诱导的小鼠T淋巴细胞以及LPS诱导的B淋巴细胞的增殖，与模型组(0 μg/mL)相比有显著性差异(p<0.05)，且抑制能力呈现剂量依赖性上升.值得注意的是Fr.100%部分提取物对于该增殖的抑制效果最为明显，其免疫抑制活性与阳性药物地塞米松相当，而Fr.0%部分提取物的抑制活性最差，对于LPS诱导的B淋巴细胞增殖没有抑制活性.

2.3 思茅藤提取物抑制炎症因子的产生

T细胞按照其产生细胞因子的种类分为Th1和Th2细胞，其中Th1细胞主要分泌TNF-α、IL-2、IL-12和IFN-γ等细胞因子[19]，参与细胞免疫和迟发型超敏反应；Th2细胞主要分泌IL-6、IL-5、IL-4和IL-10等细胞因子辅助B细胞增殖分化成抗体，主要参与体验免疫[20].在本研究中，我们分别将Th1细胞分泌的TNF-α和Th2细胞分泌的IL-6作为研究目标，评价思茅藤提取物对Con A刺激的T淋巴细胞中过量炎症因子分泌情况的影响.结果如下图4所示，经过Con A刺激后，淋巴细胞中TNF-α和IL-6的产生量均显著上升(p<0.05)，而经过思茅藤不同极性部分的提取物干预后呈现不同程度的抑制效果.其中Fr.0%～Fr.60%部分提取物对该类炎症因子的产生均无明显抑制活性(p>0.05)，而粗提取物(CE)、Fr.80%和Fr.100%部分的干预对于该趋势有显著的抑制活性(p<0.05)，其中Fr.100%抑制效果最为显著.该结果表明思茅藤提取物的免疫抑制活性物质主要集中在Fr.100%部分.而在利用大孔树脂进行极性段划分时，大多数的酚酸及酚类物质已在极性较大的Fr.0%～Fr.60%中被分离，Fr.80%和Fr.100%段只剩下极性较小的少量酚类物质和大量的甾体类成分.前期研究显示，化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione)在 10 μg/mL 浓度下的免疫抑制活性与地塞米松类似[21]，即化合物16可能为思茅藤提取物的主要活性成分之一.然而液质分析结果显示其在Fr.100%段提取物中的含量很低，但该段提取物的免疫抑制活性却明显优于Fr.80%段，这意味着除化合物16以外，思茅藤提取物中仍存在其他的有较强免疫抑制活性的甾体类化合物，且主要集中在Fr.100%段.

图2 思茅藤粗提物和不同极性部分提取物对 图3 思茅藤粗提物和不同极性部分提取物对 小鼠T淋巴细胞增殖的影响 小鼠B淋巴细胞增殖的影响

图4 思茅藤粗提物和不同极性部分提取物对Con A刺激的小鼠脾细胞IL-6和TNF-α分泌的影响

2.4 思茅藤Fr.100%段对Con A诱导的T淋巴细胞分裂周期的影响

细胞周期由间期和分裂期组成，其正常规律分布是生命活动正常进行的基本保证.其中间期包括G0/G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2/M期(DNA合成后期)，细胞增殖抑制主要发生该分裂期[22-23].上述研究结果表明思茅藤不同极性部分提取物中Fr.100%段显示出最强的淋巴细胞增殖抑制活性，因此，选择其作为研究对象，进一步通过细胞周期分布情况的测定对思茅藤提取物的免疫抑制活性机制进行初步探究.结果如图5所示，空白对照组的小鼠T淋巴细胞在体外培养 48 h 后大多数细胞处于DNA合成前期(G0/G1期)，未进入分裂周期，而经过Con A刺激后，G0/G1期细胞量显著减少，而G2/M期的细胞量显著增加(p<0.05)说明大量细胞在受刺激后进入分裂周期并发生明显的增殖现象[24].然而在思茅藤提取物作用下，大多数细胞仍停滞在G0/G1期，S期细胞数量明显减少，因此处于G2/M期细胞的数量显著降低(p<0.05)，说明Fr.100%的思茅藤提取物抑制T淋巴细胞增殖可能是通过诱导G0/G1期停滞，从而抑制T淋巴细胞向G2/M期分裂的进程，进而抑制细胞增殖[25].该结果与之前报道的从小花思茅藤(Epigynum cochinchinensis)中分离得到的甾体化合物Epigycoside E对Con A诱导的T淋巴细胞增殖抑制效果相同[12].

图5 思茅藤Fr.100%部分对T淋巴细胞增殖周期的影响

3 结语

本研究通过D101大孔吸附树脂对是思茅藤提取物进行不同极性段划分，并对6个不同极性部分的提取物进行免疫抑制活性评价.结果显示思茅藤粗提物富含甾体类化合物，且主要集中在Fr.80-100%极性段.不同极性部分提取物对Con A和LPS刺激的T和B淋巴细胞均有一定的增殖抑制活性，其中，粗提物、Fr.80%和Fr.100%能显著抑制Con A刺激的TNF-α和IL-6的分泌，且Fr.100%的抑制效果最强.通过对细胞分裂周期情况的测定发现该抑制活性主要通过阻断T淋巴细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制细胞向G2/M期分裂增殖，但其作用机制仍需要进一步深入探讨.