脂血标本对两种方法血小板计数及形态的影响分析

陈言伟，毋琦，杨晓鹏，丁金玺，佟建烨，李 浩，李启萌，郭殊君

（1.解放军联勤保障部队第九八九医院检验科，河南 平顶山 467000；2.解放军联勤保障部队第九八九医院，病理科；河南 平顶山 467000；3.平煤神马医疗集团总医院检验科，河南 平顶山 467000）

脂血既是生理现象也是病理现象，血常规是临床常规检测和急诊检测项目，标本没有要求空腹采集，其脂血发生率较高，我们更应该关注脂血标本对血常规结果的影响。脂血标本对血小板计数特别是光学法血小板计数(platelet-Optical count,PLT-O)的影响罕见报道，更缺乏系统的数据分析。笔者工作中发现两例血小板减少同时输注脂肪乳注射液（C14-24）的患者，多次PLT-O、阻抗法血小板计数(platelet-Impedance count,PLT-I)检验结果与临床不符，且同一标本PLT-O、PLT-I 结果相差甚大[1]，初步考虑脂类物质输入体内后在某个时间段干扰了PLT-O、PLT-I的计数结果。为了进一步深入研究，我们模拟脂肪乳注射液在体内的代谢环境和浓度，分别于不同时间段对模拟脂血标本进行分析，观察PLT-O、PLT-I计数结果随时间延长的变化，同时与对照组比较，分析脂血对血小板计数及其形态的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2019年5 月17 日本院体检中心5 名血型相同的健康体检人员。受试对象肝功能、肾功能、血脂及血糖等各指标正常，血小板结果PLT-I和PLT-O 均在130～300×109/L 之间，血细胞计数参数均在参考区间。清晨空腹各采集EDTA-K2 抗凝血2ml。

1.2 仪器与试剂 血小板计数使用日本Sysmex 公司XT-4000i型全自动血细胞分析仪及原装配套试剂、质控物，血细胞分析仪每半年校准1 次，且校准合格，每日测定3 个水平原厂配套质控品，室内质控在控。使用日本OLYMPUS CX-21 显微镜观察血小板形态，ABO、RhD 血型定型检测卡及抗人球蛋白检测卡（交叉配血用）购于长春博迅生物技术有限责任公司。瑞氏-姬姆萨染液按照《全国临床检验操作规程》第4 版配制后备用[2]，由中级职称以上形态学老师定期就染液对血涂片实际染色效果进行评价；苏丹Ⅲ、苏木精-伊红染液按照《临床技术操作规范·病理学分册》 第1 版配制后备用[3],以肠系膜脂肪组织的冰冻切片做阳性对照。脂肪乳注射液（C14-24）由安徽丰原药业股份有限公司提供,国药准字H34023480,批号：2118120301。

1.3 方法 将符合要求的5例标本混合均匀(混匀后排除脂血、溶血、黄疸对检测的影响),共计10ml。混合样本交叉配血卡检测无凝集、无溶血、相合。取1.8ml 混合标本加入100μl 原装稀释液EPK，立即连续上机检测3 次，记录PLT-I、PLT-O 结果，分别取均值作为对照组I和对照组O 血小板计数结果。根据常永红等[4]报道，血小板计数随放置时间变化较小，故取此次计数结果作为所有时间点观察组结果的对照。提取7.2ml 混合标本按照说明书配比添加400μl 脂肪乳注射液（C14-24）与其充分混合作为实验组。将实验组样本37°水浴箱孵育，每60min 颠倒混匀5 次，每间隔2 小时分别以PLT-O和PLT-I 方法用全自动血细胞分析仪的CBC+DIFF+RET 模式计数血小板3 次并取均值，22h 内共检测12 次。记录所有时间段PLT-I和PLT-O 数值。每个时间点检测后立即推两张血片，选择结果最高的时间点的血片染色，一张进行瑞氏-姬姆萨染色，另一张甲醛固定后先用苏丹Ⅲ初染，再用苏木精-伊红复染，分别镜检观察。另用全自动血细胞分析仪的CBC+DIFF+RET 模式对脂肪乳注射液（C14-24）原液计数血小板3 次取均值并记录PLT-I、PLT-O 数值，并分析其直方图与散点图情况。

1.4 统计学处理 统计结果采用平均值±标准差的方式表示,使用OriginPro 9.0 进行t-检验单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 为具有显著性差异。

2 结果

2.1 脂血标本血小板计数结果的影响 结果显示各个时间段脂血标本血小板计数结果与对照组结果差异均有统计学意义(P＜0.05),见表1。其中PLTO 组各时间段之间的差异只有0h与2h 之间结果无统计学意义（P=0.285），其余各时间段之间的结果差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1A 所示。而PLT-I 组从0h 到8h 血小板计数逐渐升高，时间点间血小板计数有统计学差异，8h 到16h 时间段血小板计数无显著变化（P>0.05），见图1B。

图1 脂血标本血小板计数随时间变化

表1 不同时间段脂血标本PLT-O、PLT-I结果与对照组结果比较（均值±标准差）

2.2 脂血标本血小板镜下形态观察在血小板结果最高点PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L 时，即20h 进行推片瑞氏-姬姆萨染色见图2A，苏丹Ⅲ、苏木精-伊红染色结果见图2B。由图片可见，虽然仪器报警有RBC 碎片、血小板聚集，但镜下均未查见红细胞溶解、碎片及白细胞碎片，血小板也未见聚集现象。图2A 中可见大量大小不一的类血小板颗粒物质，苏丹Ⅲ、苏木精-伊红染色结果图2B中可见脂类物质着色良好，形态大小与血小板相似。

图2 脂血标本对血小板镜下形态观察

2.3 脂血标本及脂肪乳注射液（C14-24）原液血小板计数直方图及散点图 脂血标本血小板计数的直方图及散点图如图3A 所示（仅展示计数最高点图形），脂血标本PLT-O和PLT-I 血小板计数在第20h 时分别为1362×109/L和442×109/L，脂肪乳注射液（C14-24）原液PLT-O和PLT-I 血小板计数分别为170×109/L和102×109/L；此外，脂血标本的“血小板”在图形的横坐标上荧光强度较弱，且分布集中、偏左，其左侧的荧光部分基本与脂肪乳散点图的荧光部分重叠。可见脂肪乳对PLT-O和PLT-I 血小板计数均有影响，并且对于PLT-O计数结果的影响要大于PLT-I计数结果。

图3 脂血标本(A)及脂肪乳注射液（C14-24）原液(B)血小板计数直方图及散点图

3 讨论

我们在工作中对低值血小板和假性血小板减少关注较多，而且常将PLT-O 作为异常PLT-I的复检方法[5,6]。由于临检工作量大，有的实验室应用了自动审核系统，如果复检规则设置的不全面，很难实现对散点图和直方图逐一审核。日常工作中对正常值血小板结果审核发送不是十分严谨，正常值也可能是个假象,低值血小板的假性正常或者升高会带来更加严重的后果,特别是手术患者出血风险明显增加[7,8]。所以我们在关注低值血小板的同时更应该关注低值血小板假性正常和假性增高的病例。表1 中可见脂肪乳加入后立即检测PLT-O和PLT-I 均明显增高，与对照组结果差异均有统计学意义（P＜0.05），且两者各个时间段结果与对照组结果差异均有统计学意义（P＜0.05）。图1A 中可知PLT-O 结果在0h 至2h 时间段较稳定，结果增高不明显，随着时间的延长脂类物质逐渐被代谢成类似血小板大小的颗粒物质，计数结果显著增高，于20h 到达峰值1362×109/L，是对照组结果的7.5 倍之多。图1B 中可见随着时间的延长PLT-I结果增高幅度没有PLT-O 明显，同时也在20h 达到峰值PLT-I 442×109/L，也是对照组结果的2.3倍。两种检测原理对PLT 结果的影响都非常显著，如果是低值血小板患者必定会误导临床造成严重的后果。

PLT-O 结果随着时间的延长远高于PLT-I的结果，我们分析认为：PLT-I 结果对血小板体积大小敏感，大血小板或者说颗粒物质平均体积大于12.1fl 时会造成结果偏低,另外SysmexXT-4000i 血细胞分析仪器检测PLT的下限鉴别线浮动界标为2-6fl 之间，即小于6fl的颗粒物质有可能也不会计数在内[9]。而PLT-O的检测原理是从血小板质的角度对血小板进行染色计数，弥补了阻抗法许多弊端[10]，而且近年来的研究报道证明了PLT-O在血细胞分析中的价值，已经常规用于对PLT-I 检测异常结果的复检[11,12]。但是PLT-O的检测原理的优越性也决定了它的弊端[13]。比如图3A 中PLT-O 散点图与脂肪乳的散点图图3B对比可以得到验证，脂血标本的“血小板”在图形的横坐标上荧光强度较弱，且分布集中、偏左，其左侧的荧光部分基本与脂肪乳散点图的荧光部分重叠。进而说明这些没有被PLT-I计数进去的脂类颗粒被PLT-O 当作血小板进行了计数，从而造成脂血标本中PLT-O比PLT-I 结果假性增高更加显著。

图3A 中可见仪器RBC/RET 报警区提示“碎片？”，同时也为了观察假性增高是否由于随着放置时间的延长，造成WBC 崩裂或/和RBC 破碎影响PLT计数[13,14]，于是在血小板结果最高点PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L，即20h 推片两张染色镜检，瑞氏-姬姆萨染色如图2A，红细胞形态完整无红细胞碎片、白细胞裂解物质等着色的类血小板颗粒物质。另外RBC计数并未减少，而且WBC计数随着时间的延长不但没有降低反而有所增高，对照组WBC计数为6.37×109/L，实验组0 时WBC6.49×109/L，至血小板计数最高点20 时WBC计数为13.27×109/L，WBC Flag（s）提示“幼稚粒细胞？、难溶红细胞？”等，散点图异常（原因有待进一步探讨）。可以说明PLT-O和PLT-I的增高并非RBC和WBC的影响。同时图2B 中可见大量不着色、形态大小类似血小板的颗粒物质，疑似脂类物质，且这些形态大小类血小板颗粒物质被苏丹Ⅲ染为红色。由此推测RBC/RET 报警提示的“碎片？”也是由此类物质所致。本文从金标准形态学上证实了脂血标本对血小板计数的影响，尤其对PLT-O 结果影响更为显著。由于PLT-O计数血小板原理主要是依据细胞通过核酸荧光染色后的光散射差异区别血小板和其他类血小板颗粒物质，从而明确了PLT-O 增高的原因在于脂类物质在体内分解代谢成相当于PLT 体积大小，经核酸荧光染料RET-SEARCH(Ⅱ)染色呈现与血小板类似的荧光强度，因此被仪器误认成血小板进行计数[15]。

综上所述，血常规标本没有严格要求空腹采血而且不能离心，脂血标本相对较多且不易发现，对结果的影响很容易被忽视。脂血标本代谢的不同时间段对阻抗法和光学法均有显著的影响，病情允许的情况下建议空腹采血，特别是对于既往血小板减少症的患者强烈推荐空腹采血，需要长期监测对照的患者尽量控制在同一时间采血。在审核仪器分析结果时怀疑有脂血等干扰的标本，必要时行等量血细胞稀释液置换，或者手工复核。