威尼克何德霉感染14例

郑文爱， 徐和平， 乔 凤， 吴伟伟， 杨先旭， 唐小正， 林昌炎

威尼克何德霉（Hortaea werneckii）可引起皮肤角质层感染，是传统意义上的掌黑癣（tinea nigra）的致病菌。掌黑癣临床表现为表面棕色到黑色无鳞片和不突起的斑疹，一般无自觉症状，主要影响手掌表面，也见其他部位感染的报道，包括足底、颈部和胸部，尚未发现感染指（趾）甲的文献报道。

1 材料与方法

1.1 临床资料来源

回顾性调查2016—2020年海南省第五人民医院诊断为威尼克何德霉感染患者的诊治经过，对其人口学资料、临床表现、治疗和预后进行分析。

诊断标准：临床表现+实验室检查结果。根据文献[1]，掌黑癣患者临床表现为发生于手掌、足跖或其他皮肤浅表、棕或黑色无鳞屑的斑疹。实验室检查以皮屑组织检测出威尼克何德霉即可确诊。

1.2 实验室检测

1.2.1 真菌镜检 取皮损处皮屑滴加10%氢氧化钾溶液涂片和钙白荧光染色镜检。

1.2.2 真菌培养 取皮损处皮屑或病甲屑接种于沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上，25～28℃培养5 d，观察菌落生长情况和镜下特点。见图1。

图1 威尼克何德霉的镜下特征Figure 1 Microscopic morphology of Hortaea werneckii

1.3 药敏试验

复苏上述培养分离到的威尼克何德霉，经分子生物学复核鉴定后作药物敏感性试验。

1.3.1 分子生物学鉴定 菌株转种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养5～7 d后，提取DNA进行基因测序。引物ITS1：5'-CGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 ：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由北京睿博兴科生物技术公司合成。扩增体系：2×Taq Mix 15 μL，ITS1、ITS4（3.2×10-5mol/L）各 0.5 μL，模板 2 μL。PCR 参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 7 min。用 3730x1DNA analyzer 测序仪（ABI公司） 进行测序，结果经基因库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对。

1.3.2 药物敏感试验 菌株于PDA培养5～7 d后，用肉汤微量稀释法测定特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑、氟康唑、酮康唑MIC值，操作方法按CLSI M38-A2 和M27-A3标准进行检测。

2 结果

2.1 患者临床资料

2.1.1 人口学资料 共14例威尼克何德霉感染患者，男8例，女6例。其中8例为1～12岁的儿童，6例为成人，年龄在28～58岁。所有患者均否认家族中有类似患者。

2.1.2 临床表现 8例为掌黑癣患者，1例为大腿皮肤感染，5例为甲真菌病患者。掌黑癣患者单侧手掌有单个或多个绿豆至黄豆大不规则黑褐色斑，颜色不均，部分融合成片，边界较清楚，表面无鳞屑，不高出皮面，其后黑斑逐渐增大成片（见图2）。甲真菌病患者均有不同程度的甲损坏和色素沉着，甲损坏均属于远端（侧缘）甲下型（distal lateral subungual onychomycosis，DLSO）， 甲 板远端脆裂、分离，呈棕黑色，甲下大量碎屑。

图2 掌黑癣的临床表现Figure 2 Clinical manifestations of tinea nigra

2.2 实验室检测

2.2.1 分子生物学鉴定 14株菌株经测序，结果比对均为威尼克何德霉，鉴定符合率为100%。

2.2.2 药物敏感试验 菌株按CLSI M38-A2和M27-A3标准检测MIC值，见表1。药敏试验结果显示5种抗真菌药物的MIC几何均值为：伊曲康唑0.065 7 mg/L，伏立康唑0.036 3 mg/L，特比萘芬0.038 1 mg/L，酮康唑0.048 8 mg/L，氟康唑3.281 3 mg/L。

表1 14株威尼克何德霉对5种抗真菌药物的敏感性Table 1 Susceptibility of 14 strains of Hortaea werneckii to 5 antifungal agents

2.3 治疗和转归

掌黑癣患者外用萘替芬酮康唑乳膏或盐酸特比萘芬乳膏，每日2次，5～7 d后皮损完全消退。甲真菌病患者口服伊曲康唑，每日1粒，连服7 d，停药三周，重复执行三个疗程，同时萘替芬酮康唑乳膏和盐酸阿莫罗芬擦剂交替外用，每日1次。5例甲真菌病患者只有1例痊愈，另外4例症状有一定改善，但在观察的3个疗程内疗效不明显。14株威尼克何德霉感染者的临床特征和治疗情况见表2。

表2 14株威尼克何德霉感染的临床特征和治疗情况Table 2 Summary of clinical characteristics and treatment of 14 cases of Hortaea werneckii infection

3 讨论

威尼克何德霉过去曾归属于枝孢霉，1984年，Nishimura和 Miyaji提 议 将Cladosporium wetneckii归为何德菌属（Hortaea），因其同时存在合轴产孢和环痕产孢。1992年，教科书所列名为威尼克外瓶霉（Exophiala werneckii）[2]。但最近真菌分类引入分子分类和系统进化等手段，国际权威的真菌分类mycobank网站将其分类地位重新定位为子囊菌门 （Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、煤炱目 （Capnodiales）、畸球腔菌科（Teratosphaeriaceae）、何德菌属（Hortaea）[2]。威尼克何尔德霉生长缓慢，初为酵母样菌落，表面光滑黏稠，随着培养时间延长（超过1周），菌落表面气生菌丝逐渐丰富，颜色变为橄榄黑色。成熟后菌丝暗色有隔、厚壁，产孢细胞在菌丝间生或顶生，分生孢子常为单或双细胞，有明显分隔，圆柱形或纺锤形，初为透明，后逐渐转化成为浅橄榄色，合轴方式排列，可出芽最后转化成厚壁孢子团。

威尼克何德霉是嗜盐的暗色真菌[3]。环境中广泛存在，包括土壤、下水道、腐烂的植物、腐殖土、木棍、咸味发霉的鱼等，主要出现在富含盐分的海滩上[4]。国外报道中，从海水、潜水装置、游泳池、植物、住宅及宠物中分离出威尼克何德霉[5-6]。该菌是引起掌黑癣的经典病原菌，国内外都有病例报道，海南岛也报道过该菌引起的儿童掌黑癣[7]。此病主要流行于热带、亚热带，如南美洲、非洲等，中国以长江以南为主要发病地域[8]。而中国海南岛热带、亚热带的气候，和四面环海的地理位置正是威尼克何德霉生存的温床。何德霉所引起的手掌病变是色素沉着，边缘不齐，通常单侧。其损害似乎与免疫系统和遗传易感性无关。大多数患者都有多汗症条件[4]，家庭成员之间一般不会互相传染。本文所报道的14株威尼克何德霉中有8株分离自掌黑癣患者的皮损处，其中7株分离自7例1～6岁患儿，均居住在靠海岸的城市，孩子有沙滩或其他地方玩沙土的经历，否认有外伤史；另1株分离自1名海南岛女导游，也经常接触沙滩、海水。

威尼克何德霉除了引起掌黑癣外，也可以引起身体其他部位的病变，如胸部、足底、手指等[9-11]。本文有1株菌分离自左大腿根部有褐色皮损处；另有5株菌分离自甲真菌病患者，其中2例真菌直接镜检阴性。与掌黑癣患者不同之处是，甲真菌病的患者多数是29～58岁的成年人。因未检索到国内外关于威尼克何德霉致甲真菌病的病例报道，本研究的5例甲真菌病患者均进行甲病理活检以确证，成年人活动范围广，有甲损坏的人员有可能因接触或是寄生于病甲的污染菌引起的继发感染。而甲真菌病常见的致病真菌是皮肤癣菌和酵母，加之疗效观察时间较长，所以单凭真菌直接镜检和培养（尤其是直接镜检阴性结果）不能完全肯定或排除为威尼克何德霉引起的甲真菌病，必要时需行甲病理检查。

对于威尼克何德霉导致的浅部真菌感染，常见的抗真菌药物大部分均有效，可以经验使用，临床工作中不必等待药敏试验来指导临床用药。但对于威尼克何德霉感染而疗效不明显的患者，建议临床实验室进行体外药敏试验。威尼克何德霉早期表现为黑酵母的菌落，随着培养时间延长逐渐变为丝状真菌，对于该菌的药敏试验目前尚无统一的标准，有用CLSI M27-A3酵母类的试验方法[12-13]，也有用CLSI M38-A2 丝状真菌类的肉汤稀释法[14]，测定抗真菌药物的MIC值，本研究为了对比不同的药敏试验方法对测定的MIC是否存在差异，特意对所有的菌株均同时使用CLSI M27-A3和CLSI M38-A2的方法进行测定，测定的结果显示，除了少数菌株对个别抗真菌药物的MIC值有1～2个倍比的差异外，绝大部分均相同。由于菌株数少，暂看不出两种方法测定威尼克何德霉对常用抗真菌药物MIC值方面的差异，鉴于威尼克何德霉在人体致病状态是菌丝相，所以应该采用丝状真菌的药敏试验方法来测定抗真菌药物的MIC值。本研究在参照CLSI M38-A2肉汤微量稀释法进行药敏试验时，威尼克何德霉在药敏板中生长终点十分清晰，未见明显的拖尾现象，容易判断结果，是适合临床使用的方法。药敏试验结果显示伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬对威尼克何德霉的MIC值均较低，氟康唑对个别菌株的体外活性低（Z-0497患者分离菌株，64 mg/L），结果与相关研究报道相符[12,14-15]。威尼克何德霉所致掌黑癣或躯干部位的皮损治疗一般比较简单，首选外用抗真菌制剂，如酮康唑软膏、特比萘芬乳膏，可联合角质剥脱剂，无需系统治疗[16]。但如果引起甲损坏等局部用药不能解决的问题时，应该系统用药。本研究中皮肤感染的患者外用以上药物乳膏，效果显著，说明这五种抗真菌药物目前仍适用于本地威尼克何德霉感染的治疗。