HMGA2基因沉默对肾癌细胞ACHN周期及凋亡的影响

吕光耀 蒲琳 陈乾 付启忠 刘险峰 董圣芳 杨建勋 刘颖

doi：10.3870/j.issn.1674-4624.2021.02.007

高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2, HMGA2)为目前的热点癌基因之一[1]，HMGA2蛋白参与广泛的生物学过程，包括胚胎发育、细胞周期调节、细胞分化以及肿瘤发生等多个过程[2]。前期的研究结果表明，HMGA2在肾癌患者肿瘤组织中高表达，且其蛋白表达水平与肾癌患者疾病进展时间及预后密切相关[3]，肾癌细胞ACHN经HMGA2基因沉默后，可明显抑制该细胞的增殖及侵袭能力[4-5]。为了更好的说明HMGA2在肾癌进展中发挥的重要作用，我们通过细胞瞬时转染建立HMGA2低表达细胞株，研究敲除HMGA2基因表达后，对ACHN细胞周期与凋亡的影响。

材料与方法

一、材料

ACHN细胞由凯基生物大连分公司提供。Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；鼠抗人HMGA2单克隆抗体及二抗山羊抗鼠IgG(美国Santa Cruz公司)；逆转录试剂盒与2×Taq PCR Master Mix(中国北京天根生化有限公司)；引物(中国北京奥科生物有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(凯基生物大连分公司)；HMGA2-siRNA及Mock-siRNA(上海吉玛制药公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国Invitrogen,批号V1324)；细胞周期检测试剂盒(沈阳万类生物科技)；荧光定量PCR循环仪(美国ABI Step one plus Real time-PCR system)；Trans-Blot Turbo蛋白转印系统(美国Bio-rad 186-3217)；流式细胞仪(美国Becton-Dickinson)。

二、细胞培养

用10%FBS的RPMI-1640培养基培养肾癌细胞ACHN，细胞置于5% CO2饱和湿度37 ℃培养箱中培养，细胞贴壁生长良好，2～3 d传代1次。

三、转染

使用Lipofectamine 2000 Reagent转染试剂盒说明书进行细胞瞬时转染，24 h后提取RNA行qRT-PCR检测，48 h后提取蛋白行Western Blot检测。

四、qRT-PCR法检测ACHN细胞HMGA2 mRNA的表达情况

提取总RNA，采用分光光度仪测定RNA样品的浓度，取5 μl RNA样品到495 μl 1×TE Buffer中，然后取2 μg RNA反转录成cDNA，具体操作步骤按照相应试剂盒(美国Invitrogen公司，货号CW0581)说明书进行。实验结束后行产物的溶解曲线分析其产物特异性，记录Ct值，采用2-ΔΔCt方法计算标本相对表达量，qPCR时以GAPDH为内参，每个标本都要做对应的内参，而且每次都要做。其中，ΔΔCt=(实验组HMGA2基因Ct-实验组内参基因Ct)-(对照组HMGA2基因Ct-对照组内参基因Ct)。

五、Western Blot法检测ACHN细胞HMGA2蛋白的表达情况

转染48 h后，收集ACHN细胞，裂解细胞，提取其中的总蛋白，经二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，应用使用G:BOX chemiXR5成像，Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

六、PI染色检测ACHN细胞周期情况

六孔板转染培养48 h后，无EDTA的胰酶消化细胞2 min后离心收集，PBS清洗3次后加入冷却的70%乙醇溶液，吹散变成单细胞悬液，放于-20 ℃冰箱固定。1 500 rpm离心10 min后在上机前弃去固定液，用PBS洗3次彻底去除残留乙醇，加600 μl PI染液迅速吹匀，4 ℃避光放置1 h，在488 nm波长处用流式细胞仪检测红色荧光及光散射情况，分别测定未转染组、HMGA2-siRNA组及Mock-siRNA组细胞 G0/G1期、S期和G2/M期的百分率。

七、Annexin V-FITC检测ACHN细胞凋亡情况

六孔板转染培养48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞2 min后离心收集，用PBS洗2次，2 000 rpm在4 ℃的环境下离心5 min后吸去上清保留细胞沉淀。100 μl的1×Binding Buffer重悬细胞和5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl PI Staining Solution一起混匀，室温避光反应10 min后再加入400 μl的1×Binding Buffer。用流式细胞仪检测结果，激发波长为488 nm，在FL1通道检测FITC的绿色荧光，在FL3通道检测PI的红色荧光。早期凋亡细胞：AnnexinⅤ阳性、7-AAD阴性；晚期凋亡细胞：AnnexinⅤ和7-AAD双阳性；细胞凋亡率为二者之和。

八、统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对以上各项数据进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，计量资料行方差分析。

结 果

一、HMGA2低表达肾癌细胞株的建立

选择HMGA2三个不同的基因片段分别为HMGA2-siRNA1、HMGA2-siRNA2、HMGA2-siRNA3和Mock-siRNA，采用qRT-PCR法检测发现HMGA2-siRNA各组与Mock-siRNA组及未转染组细胞相比：HMGA2 mRNA的相对表达量分别为0.08±0.00、0.04±0.00、0.12±0.02、1.05±0.05、1.00±0.04，差异有统计学意义(F=56.968，P<0.01)，见图1。

1：Non-transfected；2：Mock-siRNA；3：HMGA2-siRNA1；4：HMGA2-siRNA2；5：HMGA2-siRNA3；图1 siRNA干扰后HMGA2 mRNA表达情况(*F=56.968，与未转染组比较P<0.01)

表达量分别为0.07±0.02、0.02±0.00、0.11±0.04、0.68±0.07、0.75±0.09，HMGA2蛋白在转染HMGA2-siRNA组的表达明显低于Mock-siRNA组和未转染组，差异有统计学意义(F=27.815，P<0.01)，见图2。以上结果显示，siRNA干扰后，HMGA2 mRNA和蛋白表达均降低，说明干扰效果良好，且siRNA特异性良好。其中HMGA2-siRNA2的mRNA和蛋白表达量均最低，我们选择此基因片段做进一步研究。

1：Non-transfected；2：Mock-siRNA；3：HMGA2-siRNA1；4：HMGA2-siRNA2；5：HMGA2-siRNA3；图2 siRNA干扰后，HMGA2蛋白表达情况(F=27.815, 与未转染组比较P<0.01)

二、siRNA干扰HMGA2表达后ACHN细胞周期的变化

如图3、表1示，ACHN细胞转染HMGA2-siRNA可使G0/G1期细胞增加，而G2/M期细胞减少，HMGA2-siRNA使肾癌细胞ACHN阻滞在 G1期，所有数据来自至少3次独立实验(P<0.05)。

A：敲除Mock-siRNA后ACHN细胞周期分布情况；B：敲除HMGA2后ACHN细胞周期分布情况;C：未转染组ACHN细胞周期分布情况图3 PI染色流式细胞仪检测细胞周期(与未转染组比较P<0.05)

表1 转染HMGA2-siRNA后ACHN细胞周期分布的改变

三、siRNA干扰HMGA2表达后ACHN细胞凋亡的影响

如图4、表2示，敲除HMGA2后，ACHN细胞的总体凋亡率从5.69%上升到16.52%(χ2=10.83，P<0.05)。

A：未转染组ACHN细胞凋亡情况；B：敲除Mock-siRNA片段后ACHN细胞凋亡情况；C：敲除HMGA2后ACHN细胞凋亡情况图4 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况

表2 siRNA干扰后ACHN细胞凋亡情况

讨 论

肾癌为泌尿系统较为常见的恶性肿瘤[6]。由于起病隐匿早期往往无特异性表现，目前仍以手术切除为主，但术后复发率仍较高，约30%[7]。主要原因是由于肾癌分子生物学行为多变，传统的TNM分期和Robson分级在评估肾癌的预后方面有很大的局限性[8]，而且肾细胞癌对化疗及放疗不敏感。因此，深入研究肾癌发生、发展过程中分子作用的机制可为肾癌的临床治疗提供新的基因靶点及治疗方式。

HMGA2是一个非组蛋白染色质因子，它本身不具备转录因子活性，但可通过重组染色质使其处于开放状态或者影响DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作用来调控基因表达[9]。HMGA2可以对大量基因的转录和活化进行调节，特别是那些与细胞周期和凋亡相关的基因[10]。具体原因如下：①HMGA2诱导E2F1转录因子的活性导致细胞异常增生，促进向G2/M细胞周期的转化，促进肿瘤细胞生长[11]；②HMGA2表达升高通过cAMP抑制P120E4F表达下调，使得细胞周期素A的表达增加，干扰细胞周期，促进癌症的发生、发展[12]；③HMGA2表达升高，破坏DNA修复系统[13]。前期研究结果表明，HMGA2在肾癌细胞系786-0、769-P、ACHN中表达均高于正常肾小管上皮细胞系HKC，且ACHN细胞系表达HMGA2 mRNA和蛋白较高，ACHN细胞被HMGA2-siRNA干扰后能达到基因沉默的目的，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[4-5]。因此推测HMGA2在肾癌发生、发展过程中可能起到致癌基因的作用。肾癌细胞周期紊乱、细胞凋亡抑制是肾癌难以被彻底治愈的关键因素[14]。因此，本文在前期实验基础上探讨HMGA2基因对肾癌细胞生物学特性的影响。

本实验得出结论，采用RNA干扰技术，向ACHN细胞中转染HMGA2-siRNA，转染后HMGA2 mRNA和蛋白表达水平均下降，说明达到了基因沉默的目的，且HMGA2-siRNA特异性良好，成功构建了HMGA2低表达肾癌细胞株。随后，我们在转染后48 h经PI染色流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示，细胞转染HMGA2-siRNA可使G0/G1期细胞增加，而G2/M期细胞减少，HMGA2-siRNA使肾癌细胞ACHN阻滞在G1期。

肿瘤发生的共同特征之一是细胞周期紊乱，许多不同的证据说明，HMGA2通过上调细胞周期相关基因的表达促进肿瘤细胞增殖[15]。HMGA2可通过上调Cyclin A2、Cyclin B2的表达促进细胞周期 G2/M期的转化[16]。有研究报道HMGA2能与转录抑制p120E4F相互作用，导致Cyclin A基因的表达升高，促进细胞增殖和侵袭[17]。Cyclin A分别结合cdk2 和cdc2激酶调控细胞周期S期、G2/M期的过渡[18]， Cyclin B与p34cdc2激酶相关联，直接参与G2/M期的过渡，是细胞周期调控机制的重要组成部分[19]。

细胞凋亡是受基因调控、主动的生理性细胞自杀行为[20]，为程序性死亡。细胞增殖与凋亡之间的动态平衡对于生物个体的正常发育、自稳态维持、免疫耐受形成、恶性肿瘤的发生等有重要意义[21]。细胞凋亡是肿瘤发生、发展的一个重要环节，DNA断裂是细胞凋亡晚期的重要特征[22]。研究表明[23]，HMGA2基因主要通过破坏DNA修复系统来抑制细胞的凋亡。HMGA2能损伤DNA依赖蛋白酶的功能，损伤后可抑制非同源末端连接修复[24]，进一步调控切除修复交叉互补基因的转录，最终抑制核酸切除修复[25]；此外，HMGA2能促进共济失调性毛细血管扩张，加速Rad3相关激酶及其下游靶点激酶1的磷酸化，阻止G2/M期转化，最终促进DNA损伤修复，使基因毒物不能危害到肿瘤细胞[26]。本研究我们采用了Annexin V-FITC及PI染色法并通过流式细胞仪对三组细胞进行分析后发现，HMGA2-siRNA组细胞凋亡率较Mock-siRNA组及未转染组均显著增加，提示HMGA2基因低表达可促进肾癌细胞的凋亡。本研究仅通过siRNA敲低HMGA2 mRNA及蛋白表达，无法确认细胞周期和凋亡等表型是由HMGA2直接影响的，未进行过表达实验，也未增加更多的细胞系对本研究结果加以验证，有待在今后的工作中进一步完善。

综上所述，ACHN细胞被HMGA2-siRNA干扰后能达到基因沉默的目的，且能使ACHN细胞周期紊乱，并诱导细胞的凋亡。提示HMGA2基因与肿瘤发生、发展密切相关，下调其表达能抑制肿瘤发生、发展，是潜在的治疗靶点，值得进一步研究。