粉防己碱靶向TNF-α介导PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制骨质疏松症的作用研究

侍 方，倪 磊

在人类所有慢性代谢性骨病中，骨质疏松症最为常见，现约有2亿患者[1]，其与生理性或病理性雌激素降低密切相关。骨质疏松症在绝经后妇女中发生率显著升高，称为绝经后骨质疏松症(PMOP)[2]。PMOP发病涉及系统性炎症激活[3]。粉防己碱(TET)是从粉防己根部提取的活性物质，在抗炎、抗肿瘤、促自噬和凋亡方面发挥作用[4-5]。研究表明，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因存在多个多态性位点，与PMOP发生密切相关[6]。在去势骨质疏松症小鼠中，TNF-α水平与骨丢失、成骨细胞和骨细胞死亡呈正相关[7]。此外，研究发现NF-κB信号通路也参与了PMOP的进程，草乌甲素可降低NF-κB信号通路活性、抑制破骨细胞生成从而达到促进成骨细胞生成的效果[8]。最新研究发现，在去势骨质疏松症兔模型中，TET通过减少TNF-α的产生抑制NF-κB信号通路激活，降低p65磷酸化水平，进而发挥治疗骨质疏松症的作用[9]。但在骨质疏松症发生过程中，TET通过何种机制作用于TNF-α及NF-κB信号通路，以及这2个信号通路间的相互关系尚不清楚。因此，本研究构建去势骨质疏松症兔模型对此问题进行解析,为TET治疗骨质疏松症提供更深层次的理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 新西兰兔，雌性，20周龄，体质量3.0～3.5 kg，购自北京实验动物研究中心。实验动物许可证号：SYXK(京)2020-0038。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1试剂：TET(美国Sigma公司)，MinuteTM骨组织总蛋白提取试剂盒[中国西宝生物科技(上海)有限公司]，兔TNF-α ELISA试剂盒(美国R&D公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国ThermoFisher公司)，抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65、IκBαp-IκBα抗体(美国CST公司)，Anti-Rabbit IgG (美国Abcam公司)，化学发光底物(美国ThermoFisher公司)。

1.2.2仪器：Micro-CT小动物活体影像系统(LCT-200，Latheta公司)，酶标仪(ELX808，BioTek公司)。

1.3研究方法

1.3.1去势骨质疏松症兔模型的构建：参考文献[9-10]，采用双侧卵巢切除术法构建骨质疏松症兔模型。模型兔随机分为造模组、TET组，未切除双侧卵巢的假手术组作为对照组，每组6只。TET组每3天腹腔注射TET 40 mg/kg，对照组和造模组处理时换为生理盐水，持续4周[9]。处理后各组兔予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，Micro-CT检测骨密度(BMD)、相对骨体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁间距(Tb.Sp)，以评价兔骨质疏松程度。

1.3.2ELISA检测TNF-α水平：分离各组兔胫骨组织，根据试剂盒操作说明提取总蛋白，采用兔TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α水平。

1.3.3Western blot法检测骨组织相关蛋白表达：严格按照试剂盒提供的操作指南提取各组兔骨组织。采用12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，90 V电泳1.5～2.0 h；冰浴条件下100 mA固定电流转膜1 h，将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；配制含4.2%脱脂牛奶的TBST缓冲液，封闭PVDF膜；按比例加入抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65或IκBαp-IκBα抗体，4℃孵育过夜；TBST缓冲液充分洗涤3次，每次15 min；按比例加入Anti-Rabbit IgG二抗，室温孵育1 h；TBST缓冲液再次充分洗涤后，加入显影液显影。实验重复3次，最后经Image J软件分析蛋白含量,蛋白相对表达量=目标蛋白/β-actin。

2 结果

2.1TET处理对兔骨质疏松症的保护作用 TET组与造模组相比，兔骨组织BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高(P<0.05)，Tb.Sp降低(P<0.01)；造模组与对照组相比，兔骨组织BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著下降(P<0.01)，Tb.Sp显著升高(P<0.01)。见图1。

图1 TET处理对骨质疏松症模型兔关节软骨及骨形成的影响TET为粉防己碱；与造模组比较，aP<0.05,bP<0.01；与对照组比较，cP<0.01

2.2TET处理对兔胫骨组织中TNF-α的影响 对照组胫骨组织中TNF-α含量为(35.8±3.6)pg/ml，造模组为(58.6±5.2)pg/ml，TET组为(45.7±4.9)pg/ml，造模组兔胫骨组织中TNF-α含量显著高于对照组(P<0.01)，TET组显著低于造模组(P<0.01)。见图2。

图2 各组骨质疏松症模型兔胫骨组织中TNF-α水平比较TET为粉防己碱,TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与对照组比较，aP<0.01；与造模组比较，bP<0.01

2.3TET处理对PI3K/Akt信号通路活性的抑制作用 与对照组相比,造模组兔骨组织中p-p85和p-Akt表达水平显著升高(P<0.01)；而TET处理可显著降低兔骨组织中p-p85和p-Akt表达水平(P<0.01)。见图3。

图3 各组骨质疏松症模型兔骨组织中PI3K/Akt信号通路蛋白表达情况TET为粉防己碱；与对照组比较，aP<0.01；与造模组比较，bP<0.01

2.4TET处理对NF-κB信号通路活性的抑制作用 与对照组相比，造模组兔骨组织中p-IκBα和p-p65相对表达量均显著升高(P<0.01)；与造模组相比，TET组显著抑制兔骨组织中p-IκBα和p-p65相对表达量(P<0.01)。见图4。

图4 各组骨质疏松症模型兔骨组织中p-IκBα和p-p65蛋白表达情况TET为粉防己碱；与对照组比较，aP<0.01；与造模组比较，bP<0.01

3 讨论

在慢性代谢性骨病中，骨质疏松症最为常见，其是因生理性或病理性骨密度降低或骨结构恶化而导致患者骨折风险增高的一种疾病[11-13]。相对于男性，女性骨质疏松症发病率高，绝经后女性发病率尤高，称为PMOP。PMOP是一种涉及系统性炎症激活的骨代谢疾病[3]。研究发现，PMOP与雌激素缺乏密切相关[14-18]。绝经后女性体内雌激素水平下降，可引起核因子-κB受体活化因子/核因子-κB受体活化因子配体(RANK/RANKL)信号通路和炎症相关信号通路激活，TNF家族细胞因子合成和释放增加[19]。Xu等[20]研究发现，TNF-α可诱导SOX5上调，并调控KLF4信号通路，从而抑制人骨髓间充质细胞的成骨分化。在去势骨质疏松症兔模型中，通过抑制TNF-α能够有效缓解病情[9]。此外，与健康绝经女性相比,PMOP患者血清TNF-α水平升高，而且TNF-α水平与RANK和雌激素水平相关[21]。以上研究结果表明，TNF-α介导了PMOP的发生。

有研究还发现，在去势骨质疏松症小鼠模型中，四物汤可影响其PI3K/Akt和NF-κB信号通路活性，从而刺激骨形成[22]。Zha等[21]发现TNF-α可激活RAW264.7细胞系中PI3K/Akt信号通路，协同提高NF-κB信号通路活性，增加IκBα和p65磷酸化水平；TNF-α可增强RANKL诱导的NF-κB信号通路激活，促进破骨细胞增殖。因此推测PMOP患者血清中高水平的TNF-α可激活PI3K/Akt信号通路，从而促进破骨细胞增殖导致骨质疏松症。本研究发现，在去势骨质疏松症兔模型中，BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著降低，而Tb.Sp则显著升高；造模组兔胫骨组织中TNF-α含量高于对照组，同时伴随PI3K/Akt信号通路的激活，IκBα和p65磷酸化水平也显著升高。结果表明，在去势骨质疏松症兔模型中，骨组织中TNF-α含量增加可激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，促进破骨细胞增殖而导致骨质疏松症。

TET是从粉防己根中提取获得的天然活性物质[23]，除具有抗肿瘤、促凋亡和抗氧化等作用外，还具有显著的抗炎活性[24-27]。最新研究表明，TET可在体外抑制TNF-α的产生，抑制p65磷酸化水平，抑制RANKL诱导的破骨细胞增殖效应[9]。本研究同样发现，TET处理后可显著升高去势骨质疏松症兔模型胫骨组织中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th，降低Tb.Sp、TNF-α含量，抑制p85、Akt、IκBα和p65磷酸化，抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路活性，继而减轻骨质疏松症症状。本研究证实了TNF-α通过激活PI3K/Akt信号通路促进下游NF-κB信号通路活性,是导致骨质疏松症的主要分子机制;TET可靶向抑制TNF-α的产生，发挥治疗骨质疏松症的作用。

综上,TET可抑制TNF-α介导的PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活,减轻病情，是治疗PMOP的有效药物,为其临床应用奠定了基础。