天花粉化学成分及其对谷氨酸损伤PC12 细胞的保护作用

陆柳君，林 敏，周宇轩，葛 畅，何艺敏，张玉琴，黄庆勇，叶 淼*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州350122； 2.泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362011）

近年来，脑卒中一直为人类首位致死因素［1］，我国现有患者1 300 万，防治刻不容缓［2］。研究表明，谷氨酸兴奋性毒性是其主要发病机制之一，兴奋性毒性即由于大脑缺血缺氧后，引起谷氨酸迅速过量释放或重摄取抑制，导致细胞外谷氨酸水平增加，进而过度活化谷氨酸受体，激活细胞外钙离子内流等一系列信号通路，最终造成神经元功能异常和死亡，抑制兴奋性毒性可减轻缺血性脑组织损伤［3⁃4］。

栝楼Trichosanthes kirilowiiMaxim.为葫芦科栝楼属植物，其干燥根可入药，名为天花粉，具有清热泻火、消肿排脓的功效。以天花粉为君药的栝楼桂枝汤在临床上能显著改善脑卒中后患者肢体痉挛状态［5］，其改良方栝楼桂枝颗粒获批福建省第二人民医院院内制剂（批件号闽2013S0001）。现代药理研究表明，天花粉对大鼠脑缺血再灌注损伤具一定的神经保护作用［6⁃7］，但其药效成分未明。文献已报道的天花粉化学成分有三萜、甾体［8⁃10］、木脂素［8⁃9］、核苷酸［11］、天花粉 蛋白及 多糖等［10］，但其减轻脑缺血损伤的有效成分鲜有报道。课题组前期研究证明，栝楼中的泻根醇酸能够减轻兴奋性氨基酸引起PC12 细胞损伤［12］。

在此基础上，本实验对天花粉化学成分进行研究，从中分离并鉴定了9 个化合物，其中2～3、5、7 为首次从栝楼属分离得到，6、8～9 为天花粉中首次分离得到。另外，化合物3 为不常见的24⁃乙基胆甾醇糖苷，前期文献未报道该化合物及其苷元的波谱数据，本实验通过与文献对照，首次报道其完整碳谱及典型氢谱数据。同时，结合化合物1、5～7 的碳谱特征及前人总结规律，归纳了3 种情况下长链不饱和脂肪酸或酯中双键构型的鉴定方法，对于鉴定长链不饱和脂肪酸或酯的结构有较好的借鉴意义。最后，药理实验表明含量最高的化合物1能显著改善谷氨酸损伤PC12 细胞形态，提高细胞活力，减少LDH 释放量，在一定程度上减轻谷氨酸对PC12 细胞的损伤。

1 材料

Avance Ⅲ400 MHz 核磁共振仪（美国Bruker公司）；DECAX⁃30000 LCQ Deca XP 离子阱质谱仪（美国ThermoFinnigan 公司）；Waters 自动纯化系统、Waters Zspray 电子喷雾质谱双检测器（美国Waters 公司）；LC⁃20A 分析兼半制备高效液相色谱（配置法国SEDEX 蒸发光散射检测器）；柱色谱硅胶（100～200、200～300 目，上海盛亚化工有限公司）；MCI GEL CHP20 微孔树脂柱（日本三菱化学株式会社）；ODS⁃A 反相柱（北京绿百草科技发展有限公司）；Strata C18⁃E 硅胶基 质固相萃取（SPE）小柱（美国Phenomenex 公司）；薄层色谱硅胶板GF254（青岛海洋化工厂）；分析纯及色谱纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

PC12 细胞（北京北卡创联生物技术研究院）；胰蛋白酶、RPMI⁃1640 培养基、胎牛血清均购于美国Hyclone 公司；谷氨酸、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购于美国Sigma 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。SW⁃CJ⁃2FD 超净工作台（苏州安泰空气技术公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司）；Infinite M200 Pro 酶联免疫检测仪（瑞士TECAN 公司）；YS100 倒置显微镜（江南光电集团有限公司）。

天花粉（38.0 kg）购自河北省安国市天康药材有限公司，经福建中医药大学杨成梓教授鉴定为葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowiiMaxim.的干燥根。

2 提取与分离

天花粉（38.0 kg）用甲醇进行热回流提取3次，每次8 h，减压浓缩得甲醇提取物（3.2 kg）。依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取4 次。得石油醚、乙酸乙酯和水3 个部位。其中乙酸乙酯部位（160.3 g）用硅胶柱CH2Cl2⁃CH3OH（20 ∶1、15 ∶1、9 ∶1、7 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、0 ∶1）梯度洗脱，得到7 个馏分（Fr.1～7）。Fr.1（16.5 g）经C18反相柱（95% CH3OH⁃H2O）洗脱后，再经反相半制备HPLC（93% CH3CN⁃H2O）进一步纯化，得化合物9（2.8 mg）。Fr.2（19.2 g）经硅胶柱CH2Cl2⁃CH3OH（18 ∶1）洗脱，得Fr.2.1～5。Fr.2.1 经MCI 柱经90% CH3OH⁃H2O 洗脱，半制备HPLC（93% CH3OH⁃H2O）纯化得化合物5（9.44 mg）。Fr.2.3 的SPE 固相萃取柱50% CH3OH⁃H2O洗脱部分得化合物4（9.3 mg）；SPE 的95%CH3OH⁃H2O 洗脱部分（36.5 mg）经半制备HPLC（92% CH3CN⁃H2O）纯化得化合物6（4.1 mg）、7（5.6 mg）。Fr.3（11.5 g）采用硅胶柱，CH2Cl2⁃CH3OH（15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）梯度洗脱，得Fr.3.1～4。Fr.3.2（92.3 mg）经SPE 固相萃取柱70% CH3OH⁃H2O 洗脱后，得化合物8（6.5 mg）。Fr.3.4（55.2 mg）经 C18反相柱 CH3OH⁃H2O（80%～100%）梯度洗脱，收集90%洗脱部分，经半制备HPLC（95%CH3CN⁃H2O）纯化，得化合物3（6.4 mg）、2（13.7 mg）。Fr.5（28.4 g）经MCI CH3OH⁃H2O（80%～100%）梯度洗脱，取其80%洗脱组分（1.1 g）中的52.5 mg，经半制备HPLC（94%CH3OH⁃H2O）纯化，得化合物1（18.2 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末。ESI⁃MSm／z：714.5［M＋H］＋，分子量713。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：8.42（1H，d，J＝8.92 Hz，NH），6.00（1H，dd，J＝15.40，6.30 Hz，H⁃4），5.92（1H，dd，J＝15.40，6.28 Hz，H⁃5），5.51（2H，m，H⁃8，9），4.93（1H，d，J＝7.76 Hz，H⁃1″），4.85（1H，m，H⁃2），4.78（1H，m，H⁃3），4.75（1H，dd，J＝10.73，5.81 Hz，H⁃1a），4.61（1H，dd，J＝8.00，3.68 Hz，H⁃2′），4.53（1H，dd，J＝11.90，2.32 Hz，H⁃6″a），4.38（1H，dd，J＝11.84，5.36 Hz，H⁃6″b），4.25（1H，dd，overlapped，H⁃1b），4.24（2H，dd，overlapped，H⁃3″，4″），4.07（1H，dd，overlapped，H⁃2″），3.92（1H，m，H⁃5″），2.10～2.21（4H，m，H2⁃6，10），1.98～2.09（2H，m，H⁃7），1.26（br s，20×CH2，H⁃3′～15′，11～17），0.87（6H，t，J＝6.97 Hz，CH3⁃16′，18）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：175.5（C⁃1′），131.9（C⁃5），131.7（C⁃4），130.9（C⁃9），129.7（C⁃8），105.4（C⁃1″），78.3（C⁃5″），78.2（C⁃3″），74.9（C⁃2″），72.3（C⁃2′），72.1（C⁃3），71.3（C⁃4″），69.9（C⁃1），62.4（C⁃6″），54.3（C⁃2），35.4（C⁃3′），32.7（C⁃6），32.6（C⁃10），32.5（C⁃7），32.5（C⁃14′），31.8～29.2（16×CH2，C⁃4′～13′，11～16），22.7（C⁃15′，17），14.1（C⁃16′，18）。以上数据与文献［13］ 基本一致。此外，课题组还利用Johns 等［14］总结的判断不饱和长链脂肪酸中双键构型的方法，进一步确认了Δ4E和Δ8E构型。长链中2 个双键间隔2 个及2 个以上亚甲基，Z型双键邻位亚甲基的化学位移约δ27；E型的约δ32；显然，化合物1碳谱中的3 个化学位移在δ32 左右的碳信号（C⁃6、7、10）证明了Δ4E和Δ8E构型。故鉴定为大豆脑苷I。

化合物2：白色粉末。ESI⁃MSm／z：579.4 ［M＋H］＋，分子量578。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.01（1H，d，J＝7.68 Hz，H⁃1′），4.61（1H，br d，J＝11.68 Hz，H⁃6′a），4.44（1H，dd，J＝11.92，5.32 Hz，H⁃6′b），4.30（1H，t，J＝8.96 Hz，H⁃4′），4.27（1H，t，J＝9.00 Hz，H⁃3′），4.05（1H，dd，overlapped，H⁃2′），3.97（1H，dd，overlapped，H⁃5′），3.96（1H，m，H⁃3），1.24（2H，m，H2⁃28），1.00（3H，d，J＝6.76 Hz，CH3⁃21），0.99（3H，s，CH3⁃19），0.89（3H，t，J＝7.36 Hz，CH3⁃29），0.87（3H，d，overlapped，CH3⁃27），0.86（3H，d，overlapped，CH3⁃26），0.61（3H，s，CH3⁃18）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：102.7（C⁃1′），78.9（C⁃3），77.6（C⁃5′），76.3（C⁃3′），74.8（C⁃4′），72.3（C⁃2′），63.4（C⁃6′），57.1（C⁃14），56.8（C⁃17），54.7（C⁃9），46.9（C⁃24），44.2（C⁃5），42.9（C⁃13），39.8（C⁃12），38.1（C⁃4），37.6（C⁃1），36.0（C⁃20），35.5（C⁃10），34.5（C⁃22），32.6（C⁃7），31.2（C⁃2），30.4（C⁃8），29.4（C⁃25），28.9（C⁃6），28.6（C⁃16），26.2（C⁃23），23.8（C⁃15），23.4（C⁃28），21.1（C⁃11），20.0（C⁃26），19.1（C⁃27），18.3（C⁃21），12.9（C⁃29），12.6（C⁃19），11.9（C⁃18）。以上数据与文献［15］ 基本一致。但是，课题组认为该文献中有关豆甾烷醇⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷中C⁃24 的立体构型的确定严谨不足。根据Wright 等［16］总结的数对互为C⁃24 位差向异构体胆甾烷类化合物的碳谱规律，可依据C⁃20、C⁃23～27 的碳谱数据差异来判断C⁃24 构型。由于C⁃24 位差向异构体的以上碳谱数据差值很小，因此需要将甾体苷水解后，用苷元的碳谱数据进行判断。因此认为化合物2 的C⁃24 的立体构型暂无法确定，故鉴定为（24ξ）⁃24⁃乙基⁃胆甾⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷。

化合物3：白色粉末。ESI⁃MSm／z：577.4 ［M＋H］＋，分子量576。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.27（1H，dd，J＝15.28，9.04 Hz，H⁃22），5.24（1H，dd，J＝15.20，8.96 Hz，H⁃23），5.03（1H，d，J＝7.96 Hz，H⁃1′），4.60（1H，br d，J＝11.34 Hz，H⁃6′a），4.47（1H，dd，J＝12.00，5.33 Hz，H⁃6′b），4.34（1H，t，J＝9.55 Hz，H⁃4′），4.32（1H，t，J＝9.55 Hz，H⁃3′），4.05（1H，dd，overlapped，H⁃2′），3.97（1H，dd，overlapped，H⁃5′），3.96（1H，m，H⁃3），1.26（2H，m，H2⁃28），1.12（3H，d，J＝7.62 Hz，CH3⁃21），0.92（3H，s，CH3⁃19），0.90（3H，t，overlapped，CH3⁃29），0.88（3H×2，d，J＝5.80 Hz，CH3⁃26，27），0.62（3H，s，CH3⁃18）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：138.8（C⁃22），130.3（C⁃23），102.6（C⁃1′），79.0（C⁃3），77.6（C⁃5′），75.8（C⁃3′），74.8（C⁃4′），72.2（C⁃2′），63.3（C⁃6′），57.7（C⁃17，14），54.7（C⁃9），51.8（C⁃24），44.7（C⁃5），43.9（C⁃13），40.2（C⁃20），39.6（C⁃12），37.9（C⁃4），37.1（C⁃1），35.4（C⁃10），32.5（C⁃7），31.1（C⁃25），31.1（C⁃2），30.4（C⁃8），28.8（C⁃6），28.7（C⁃16），25.6（C⁃28），23.7（C⁃15），21.6（C⁃26），21.6（C⁃11），21.6（C⁃21），19.7（C⁃27），13.3（C⁃19），12.6（C⁃18），12.5（C⁃29）。化合物3 与2 结构中A～D环的13C⁃NMR 数据几乎完全一致。但化合物3 的氢谱比2 多了一对反式烯氢信号［δ5.27（1H，dd，J＝15.28，9.04 Hz，H⁃22）；δ5.24（1H，dd，J＝15.20，8.96 Hz，H⁃23）］；相应的，化合物3 的碳谱比2 多了2 个烯碳信号［δ138.8（C⁃22），δ130.3（C⁃23）］。表明化合物3 为2 的C⁃22，23 去氢化物。将化合物3 侧链的碳谱数据与文献［16］对照，几乎完全一致，类似化合物2，3 中C⁃24 立体构型亦无法确定，故鉴定为（24ξ）⁃24⁃乙基⁃胆甾⁃22⁃烯⁃3⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖。在自然界中，24⁃乙基胆甾醇类 甾体很常见，但多具Δ5、Δ5，22、Δ7、Δ7，22双键，然化合物3 仅有Δ22双键的较为少见，仅在远 志［17］、盘基网柄菌［18］、Gypsophila struthium［19］中分离得到单体，在番杏［20］中检测到。且本研究首次报道了其波谱数据。

化合物4：白色粉末。ESI⁃MSm／z：321.0 ［M＋Na］＋，分子量298。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：7.47（4H，d，J＝8.25 Hz，H⁃3，5，3′，5′），7.25（4H，d，J＝8.50 Hz，H⁃2，6，2′，6′），4.94（2H，d，J＝3.70 Hz，H⁃7，7′），4.29（2H，dd，J＝8.74，6.86 Hz，H⁃9a，9′a），3.97（2H，dd，J＝9.20，3.60 Hz，H⁃9b，9′b），3.18（2H，m，H⁃8，8′）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：158.3（C⁃4，4′），132.4（C⁃1，1′），128.1（C⁃2，6，2′，6′），116.0（C⁃3，5，3′，5′），86.0（C⁃7，7′），71.6（C⁃9，9′），54.5（C⁃8，8′）。以上数据与文献［21］ 基本一致，故鉴定为ligballinol。

化合物5：白色粉末。ESI⁃MSm／z：377.3 ［M＋Na］＋，分子量354。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.39（4H，m，H⁃9′，10′，12′，13′），4.20（2H，m，H2⁃1），3.96（1H，m，H⁃2），3.70（2H，m，H2⁃3），2.80（2H，J＝5.18 Hz，H2⁃11′），2.37（2H，m，H2⁃2′），2.19（4H，m，H2⁃8′，14′），1.65（2H，m，H2⁃3′），1.26（m，7×CH2，H2⁃4′～7′，15′～17′），0.87（3H，t，J＝7.18 Hz，CH3⁃18′）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：174.3（C⁃1′），130.2（C⁃9′），130.0（C⁃13′），128.1（C⁃10′），127.9（C⁃12′），70.3（C⁃2），65.1（C⁃1），63.3（C⁃3），34.1（C⁃2′），31.5（C⁃16′），29.6（C⁃6′，15′），29.2（C⁃5′，7′），29.1（C⁃4′），27.2（C⁃8′，14′），25.0（C⁃11′），24.9（C⁃3′），22.7（C⁃17′），14.1（C⁃18′）。以上数据与文献［22］ 基本一致，且通过Johns等［14］总结规律，确定其Δ9Z，12Z构型，故鉴定为亚油酸甘油酯。

化合物6：淡黄色 油状物。ESI⁃MSm／z：281.3 ［M＋H］＋，279.5 ［M⁃H］＋，分子量280。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.45（4H，m，H⁃9，10，12，13），2.88（2H，J＝5.56 Hz，H2⁃11），2.48（2H，m，H2⁃2），2.07（4H，m，H2⁃8，14），1.75（2H，m，H2⁃3），1.31（br s，7×CH2，H2⁃4～7，15～17），0.83（3H，t，J＝7.60 Hz，CH3⁃18）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：180.1（C⁃1），130.3（C⁃9），130.1（C⁃13），128.4（C⁃10），128.3（C⁃12），34.0（C⁃2），31.9（C⁃16），29.7（C⁃7），29.4（C⁃5），29.3（C⁃15），29.2（C⁃4，6），27.6（C⁃8，14），25.3（C⁃3），25.1（C⁃11），23.1（C⁃17），14.3（C⁃18）。以上数据与化合物5 的羧酸部分以及文献［23］ 基本一致，故鉴定为亚油酸。

化合物7：淡黄色 油状物。ESI⁃MSm／z：317.4 ［M＋Na］＋，分子量294。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.49～5.38（4H，m，H⁃9，10，12，13），2.90（2H，m，H2⁃11），2.51（2H，J＝6.72 Hz，H2⁃2），2.07（4H，m，H2⁃8，14），1.77（2H，m，H2⁃3），1.24（br s，8×CH2，H⁃4～7，15～18），0.92（3H，t，J＝6.58 Hz，CH3⁃19）；13C⁃NMR（100 MHz，C5D5N）δ：180.2（C⁃1），130.4（C⁃9），130.2（C⁃13），128.4（C⁃10，12），34.2（C⁃2），32.1（C⁃17），29.8（C⁃7），29.5（C⁃5），29.3（C⁃15），29.2（C⁃6），29.2（C⁃4），29.1（C⁃16），27.4（C⁃14），27.3（C⁃8），25.3（C⁃11），25.0（C⁃3），23.0（C⁃18），14.2（C⁃19）。以上数据与文献［24］ 基本一致，类似化合物6，进一步确认Δ9Z，12Z构型，故鉴定为（9Z，12Z）⁃9，12⁃十九碳二烯酸。

化合物8：黄色油状物。ESI⁃MSm／z：279.4［M＋Na］＋，255.3 ［M⁃H］－，分子量256。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：2.34（2H，t，J＝8.60 Hz，H2⁃2），1.63（2H，m，H2⁃3），1.25（24H，br s，12×CH2，H2⁃4～15），0.88（3H，t，J＝8.60 Hz，CH3⁃16）。从其质谱和氢谱数据可推测化合物8 为一个典型的不含双键的长链脂肪酸，以上数据与文献［25］ 基本一致，故鉴定为正十六烷酸。

化合物9：黄色油状物。ESI⁃MSm／z：363.2［M＋Na］＋，375.2 ［M＋Cl］＋，分子量340。1H⁃NMR（400 MHz，C5D5N）δ：2.55（2H，J＝7.44 Hz，H2⁃2），1.82（2H，m，H2⁃3），1.28（36H，br s，18×CH2，H2⁃4～21），0.88（3H，t，J＝6.68 Hz，CH3⁃22）。从其质谱和氢谱数据可知，化合物9 应为8的同系物，以上数据与文献［26］ 基本一致，故鉴定为正二十二烷酸。

4 对谷氨酸诱导PC12 细胞损伤的保护作用

4.1 细胞培养、药物处理以及形态观察 PC12 细胞培养于含10%胎牛血清、100 U／mL 青霉素和链霉素溶液的RMPI⁃1640 完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2～3 d 传代1 次，倒置显微镜下观察细胞生长状态，选取对数生长期的细胞进行实验。取对数生长期的PC12 细胞，按照2×104个／孔接种于96 孔培养板上，于37 ℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养24 h 后，用PBS 轻轻荡洗1 次，按分组需要给药。正常对照组加入等量的1640 培养基；谷氨酸模型组和给药组分别加入1640 培养基和不同浓度的化合物1，预孵育24 h后，再加入谷氨酸使其终浓度为15 mmol／L，孵育6 h。在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

4.2 MTT 法检测细胞存活率 细胞孵育结束后，每孔加入10 μL 5 mg／mL MTT 溶液，继续培养4 h，吸弃培养基，每孔加入100 μL DMSO，待蓝紫色甲瓒晶体完全溶解后，用酶联免疫检测仪测定570 nm波长下各孔吸光度（A），细胞存活率＝（A实验组／A对照组）×100%。

4.3 LDH 水平测定 细胞孵育结束后收集细胞上清液，按照试剂盒说明书操作，酶联免疫检测仪在450 nm 波长下测定A，计算LDH 水平。

4.4 化合物1 对谷氨酸损伤PC12 细胞形态的影响 细胞培养与处理后，采用倒置显微镜观察其形态变化，并拍摄细胞图像，结果见图1。与正常组比较，谷氨酸组的PC12 细胞损伤明显，细胞形态变圆、部分细胞脱落；与谷氨酸组比较，不同浓度的化合物1 预处理组PC12 细胞的形态明显改善，细胞间链接紧密，并且随着剂量的增加，细胞贴壁数逐渐增多，生长状态良好。

图1 化合物1 对谷氨酸诱导的PC12 细胞形态的影响Fig.1 Effect of compound 1 on glutamate⁃induced PC12 cell morphological changes

4.5 化合物1 对谷氨酸损伤PC12 细胞活力的影响 与正常组比较，给药组细胞的存活率没有显著变化，见图2A。采用15 mmol／L 谷氨酸处理PC12细胞6 h 后，与正常组比较，谷氨酸组细胞活力下降至50.87%（P＜0.01）；采用0.1、1、10、50、100 μmol／L 的化合物1 预处理PC12 细胞后，细胞活力较模型组有所上升，分别上升至52.24%、53.55%、56.40%、66.81%、74.32%，随着化合物1 剂量的增加有明显的量效关系。其中，化合物1 浓度为50 μmol／L（P＜0.05）、100 μmol／L（P＜0.01）时，能显著提升PC12 细胞活力，见图2B。4.6 化合物1 对谷氨酸损伤PC12 细胞LDH 释放的影响 与正常组比较，谷氨酸（15 mmol／L）处理PC12 细胞后，LDH 释放量增加到261.92%（P＜0.01）。采用0.1、1、10、50、100 μmol／L 的化合物1 预处理PC12 细胞后，LDH 释放量分别下降至231.13%、223.24%、219.71%、202.63%、182.62%，呈量效关系。其中，化合物1 浓度为50 μmol／L（P＜0.05）、100 μmol／L（P＜0.01）时更显著，见图3。

图2 不同浓度化合物1 对正常PC12 细胞（A）及谷氨酸损伤PC12 细胞（B）活力的影响（， n＝6）Fig.2 Effects of compound 1 at different concentrations on normal（A）and glutamate⁃induced（B）PC12 cell viability（， n＝6）

图3 不同浓度化合物1 对谷氨酸诱导损伤的PC12 细胞LDH 释放的影响（， n＝6）Fig.3 Effects of compound 1 at different concentrations on glutamate⁃induced LDH leakage（， n＝6）

5 讨论

本研究从天花粉的乙酸乙酯部位中分离并鉴定了9 个化合物，包括1 个脑苷脂（1）、2 个甾体糖苷（2～3）、1 个木脂素（4）、1 个脂肪酸甘油酯（5）和4 个长链脂肪酸（6～9）。其中，化合物3为仅含Δ22双键的24⁃乙基胆甾醇糖苷，其结构较为少见，本研究首次报道了其波谱数据。

本实验结合化合物的碳谱特征和文献［14］，梳理了以下3 种情况的长链不饱和脂肪酸或酯中双键构型的鉴定方法：（1）不饱和长链中仅一个双键，主要依据双键邻位亚甲基的化学位移进行判断，Z型双键邻位亚甲基化学位移约δ27，E型的约δ32，此外烯碳化学位移也有细微差异，E型（δ130.6，130.3）较Z型（δ130.0，129.8）更低场；（2）不饱和长链含多个双键，2 个双键间隔2 个及以上亚甲基，判断方法同情况一；（3）不饱和长链含多个双键，2 个双键仅间隔1 个亚甲基，可依据以下3 点判断，（3.1）2 个双键均为Z型，双键中间亚甲基的化学位移约δ25，若均为E，中间亚甲基化学位移约δ35；（3.2）Z型双键另一邻位亚甲基（非双键中间亚甲基）化学位移约δ27；E型的为δ32；（3.3）2 个双键均为E，烯碳化学位移（δ131.1、130.9、128.8、128.7）较Z型更低场（δ130.2、130.0、128.2、128.1）。

本次分离鉴定的9 个化合物中，化合物1 含量在天花粉醇提物中占显著优势，并且其神经保护作用尚未见报道。为了进一步研究天花粉神经保护作用的物质基础，本实验检测其对谷氨酸损伤PC12细胞的保护作用，结果表明它在50、100 μmol／L时，能显著的改善损伤细胞的形态，提高细胞活力，同时减少LDH 释放。文献表明，化合物8［27］、6［28］的同分异构体混合物共轭亚油酸亦能减轻谷氨酸对于PC12 细胞的损伤，并且都与上调Bcl⁃2 蛋白表达有关。结合本实验结论及前人研究成果，推断天花粉对于缺血性脑卒中的治疗作用可能与抑制谷氨酸诱导的兴奋性毒性相关，其中化合物1 为其主要药效物质基础之一。