鞣花酸磷脂复合物的制备及其口服生物利用度研究

张留超，刘勇华

（黄河科技学院，河南 郑州 450005）

文献［5⁃7］ 报道，药物与磷脂形成磷脂复合物后其水溶性、脂溶性均可得到提高，有助于促进药物口服吸收；蒋新龙等［8］采用质子溶剂乙醇作为反应溶剂制备了鞣花酸磷脂复合物，但其复合率不足92%，可能与溶剂选择不当、工艺考察不精确有关。本实验以非质子溶剂四氢呋喃为反应溶剂［9］制备鞣花酸磷脂复合物，并考察其口服生物利用度，以期为相关制剂研究提供参考。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；SH23⁃1 型磁力搅拌器（上海江星仪器有限公司）；AR1140 型电子天平［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］；DZF⁃6050 型真空干燥箱（上海欣齐科学仪器有限公司）；XPert Powder 型X 射线衍射仪（英国马尔文公司）；RE⁃3000 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

鞣花酸原料药（纯度98.0%，批号190320，武汉荆楚陈氏医药化工有限公司）；鞣花酸对照品（纯度99.6%，批号110726⁃201707，中国食品药品检定研究院）；大豆卵磷脂（批号PC98T，磷脂酰胆碱质量分数＞98%，上海辅必成医药科技有限公司）。清洁级SD 大鼠，体质量180～220 g，购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（豫）2016⁃0012。

2 方法与结果

2.1 鞣花酸磷脂复合物制备 取50 mg 原料药（45 ℃下真空干燥1 d）、处方量磷脂，置于三角瓶中，加入四氢呋喃制得混悬液，立即密封，置于一定温度水浴中，磁力搅拌适当时间后得澄清溶液，真空旋蒸除去有机溶剂，即得（性状为浅黄色半固体）。

2.2 鞣花酸含量测定

2.2.1 色谱条件 Waters Extend⁃C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长254 nm；流动相甲醇⁃水（含0.1%磷酸）（45 ∶55）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；进样量20 μL。

2.2.2 线性关系考察 精密称取鞣花酸对照品10.0 mg，溶于1.0 mL 四氢呋喃中，甲醇定容至10 mL，得1.0 mg／mL 母液，精密吸取1.0 mL 至100 mL量瓶中，流动相定容至刻度，得到10.0 μg／mL对照品溶液，“2.2.1”项下流动相稀释至10.0、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg／mL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y）对鞣花酸质量浓度（X）进行回归，得方程为Y＝14.314 2X＋0.648 9（r＝0.999 8），在0.05～10.0 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备 取鞣花酸磷脂复合物约10 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取2.5 mL 至10 mL 量瓶中，“2.2.1”项下流动相定容至刻度，即得。

1.2 标本采集 抽取孕妇空腹外周静脉血5 ml装入真空普管中。待自凝后取血清3 000 r/min低温离心5 min，吸取上清液，置于-22°冰箱保存待同批测量。

2.2.4 方法学考察 取鞣花酸磷脂复合物适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸峰面积RSD 为1.20%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸峰面积RSD 为0.58%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。取“2.2.2”项下0.5、2.5、10.0 μg／mL对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得鞣花酸峰面积RSD 分别为0.62%、0.43%、0.16%，表明仪器精密度良好。称取9 份鞣花酸磷脂复合物，加入“2.2.2”项下1.0 mg／mL对照品溶液1.25、2.50、3.75 mL，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸平均加样回收率分别为98.96%、100.68%、99.17%，RSD 分别为1.11%、0.84%、1.50%。

2.3 复合率测定 精密称取一定量鞣花酸（X0）制备磷脂复合物，加入10 mL 乙醚，振荡溶解后过0.22 μm 微孔滤膜，滤液减压旋蒸除去乙醚，收集固体至100 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取2.5 mL至10 mL 量瓶中，“2.2.1”项下流动相定容，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定参加复合的鞣花酸质量（X1），计算复合率，公式为复合率＝（X1／X0）×100%。

2.4 Box⁃Behnken 响应面法 固定鞣花酸用量不变，课题组前期发现磷脂用量（A）、制备温度（B）、制备时间（C）是影响复合率的主要影响因素，三者水平见表1。再选择复合率（Y）作为评价指标，采用Box⁃Behnken 响应面法优化制备工艺，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

对表2 数据进行拟合，得到二次多元回归方程为Y＝93.16 ＋6.89A＋3.90B＋5.51C－ 2.58AB－1.40AC－5.47BC－4.33A2－0.55B2－2.33C2（R2＝0.983 3，P＜0.000 1，F＝0.082 5，＝0.961 9），R2较接近，表明拟合度良好；F＞0.05，表明未知影响因素对实验结果干扰很小，模型可信度较高，方差分析见表3。由此可知，各因素对复合率均有显著影响（P＜0.01），以A更明显，可能是由于磷脂用量不足会严重影响复合率所致，并且交互项AB、BC也有显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

通过Design Expert V8.0.6 软件进行分析，结果见图1。由图1a～1b 可知，固定某一因素时复合率随均随着另外2 个因素同时增加而增大，而后有所下降；由图1c 可知，虽然随着制备温度、制备时间增加复合率逐渐增大，但达到一定程度时反而明显下降，可能是过高的制备温度、过长的制备时间会对磷脂或其复合物稳定性产生一定影响，从而影响复合率。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

设置复合率最大值为100%，最小值为0，得到最优制备工艺为磷脂用量141.6 mg（鞣花酸与磷脂比例约为1 ∶1.1），制备温度46.9 ℃，制备时间4.7 h，复合率为99.0%。按上述优化工艺制备3 份鞣花酸磷脂复合物，测得复合率分别为99.4%、99.7%、98.9%，平均99.3%，与预测值99.0%接近（相对误差为0.3%），表明模型预测性、重复性良好。

2.5 存在状态分析 XRPD 扫描条件为Cu⁃Kα 靶，扫描范围（2θ）4°～40°，电 流40 mA，速 度8°／min。取约10 mg 待测物，玻璃片压平后固定于X 射线粉末衍射仪上测定，结果见图2。由此可知，原料药在9.3°、10.1°、12.1°、28.4°等处出现特征晶型峰；在物理混合物（比例同磷脂复合物）中，磷脂、鞣花酸强度均发生较大幅度的下降，前者晶型衍射峰基本消失，但仍可发现后者在12.1°、28.4°处的特征晶型峰；磷脂复合物中鞣花酸所有晶型衍射峰均消失，表明它是不同于物理混合物的一种物质，鞣花酸在其中以无定型状态存在。

图2 样品XRPD 图Fig.2 XRPD patterns for samples

2.6 溶解度测定 取过量鞣花酸、物理混合物、磷脂复合物至三角瓶中，加入蒸馏水或正辛醇，25 ℃下磁力搅拌48 h，分别取3 mL 至离心管中，6 000 r／min 离心5 min，取上清液，测定表观溶解度，结果见表4，可知鞣花酸制成磷脂复合物后在水、正辛醇中的表观溶解度分别提高至3.22、7.18 倍。另外，该成分在物理混合物中的溶解度也有所提高，可能是由于磷脂增溶作用所致。

表4 样品表观溶解度测定结果（， n＝6）Tab.4 Results of apparent solubility determination of samples（， n＝6）

表4 样品表观溶解度测定结果（， n＝6）Tab.4 Results of apparent solubility determination of samples（， n＝6）

注：与鞣花酸比较，**P＜0.01；与物理混合物比较，＃＃P＜0.01。

2.7 口服生物利用度研究

2.7.1 分组、给药与采血 取原料药、物理混合物、磷脂复合物适量，加入0.5% CMC⁃Na 溶液，超声30 s 后得混悬液（鞣花酸质量浓度均为15 mg／mL）。取过夜禁食的18 只大鼠，随机分为原料药组、物理混合物组、磷脂复合物组，每组6只，灌胃给药，剂量100 mg／kg，灌胃后立即计时，于0.15、0.25、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 将大鼠置于盛有乙醚的容器中麻醉10 s后，立即用浸润有肝素抗凝剂的玻璃毛细管眼眶采血各约0.2 mL，引流至涂有肝素抗凝的离心管中，3 000 r／min 离心2 min，血浆保存于－10 ℃冰箱中。

2.7.2 血浆样品处理 参考文献［3，10］ 报道的方法，取100 μL 血浆样品，加入150 μL 1 mol／L KH2PO4、20 μL 50%磷酸，涡旋混合5 min，加入1 mL 乙腈涡旋混合5 min，7 500 r／min 离心5 min，转移上清液，再加入0.5 mL 乙腈洗涤，合并2 次上清液，N2缓慢吹干，于残渣中加入100 μL 甲醇，超声10 s，7 500 r／min 离心5 min。

2.7.3 线性关系考察 取鞣花酸对照品适量，甲醇制成1 000、500、250、100、50、25 ng／mL 对照品溶液，分别取100 μL 至离心管中，氮气缓慢吹干得残渣，加入100 μL 空白血浆，涡旋5 min，即得1 000、500、250、100、50、25 ng／mL 血浆对照品溶液，按“2.7.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），鞣花酸质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程Y＝0.012 5X＋0.055 3（r＝0.993 8），在25～1 000 ng／mL 范围内线性关系良好。

2.7.4 方法学考察 取空白血浆、含药血浆（磷脂复合物给药12 h）、空白血浆＋25 ng／mL 血浆对照品溶液，按“2.7.2”项下方 法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图3，可知鞣花酸出峰时间为9.6 min，血浆内源性物质不干扰测定，专属性强。室温下于0、4、8、12、24、48 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得鞣花酸峰面积RSD 为6.39%，表明样品在48 h 内稳定性良好。取“2.7.3”项 下25、250、1 000 ng／mL血浆对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得鞣花酸峰面积分别为3.14%、4.04%、1.68%，表明仪器精密度良好。取鞣花酸对照品适量，按“2.7.3”项下方法制备25、250、1 000 ng／mL 血浆对照品溶液，按“2.7.2”项下方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为90.43%、87.69%、92.05%，RSD 分别为4.07%、3.22%、2.48%。将“2.7.3”项下25 ng／mL 血浆对照品溶液逐步稀释，测得定量限（S／N＝10）为5.0 ng／mL，检测限（S／N＝3）为2.0 ng／mL。

图3 鞣花酸HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of ellagic acid

2.7.5 药动学研究 图4、表5 显示，与原料药、物理混合物比较，磷脂复合物tmax缩短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相对生物利用度提高至2.46 倍。

表5 鞣花酸主要药动学参数（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for ellagic acid（， n＝6）

表5 鞣花酸主要药动学参数（， n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for ellagic acid（， n＝6）

注：与原料药比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与物理混合物比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

图4 鞣花酸血药浓度⁃时间曲线Fig.4 Plasma concentration⁃time curves for ellagic acid

3 讨论

本实验选择非质子溶剂（四氢呋喃）制备鞣花酸磷脂复合物，其复合率高于质子溶剂（如乙醇等）制备者，可能是质子溶剂会对药物和磷脂形成复合物时产生一定干扰作用，从而影响了复合率。所得最优制备工艺的复合率接近100%，而且鞣花酸在水、正辛醇中的溶解度分别提高至3.22、7.18 倍，远高于乙醇制备者（1.4、2.1 倍）［8］，具体原因有待进一步研究。

在血浆样品处理过程中，药物损失会影响含量测定的准确性，一般采用内标法。但对于鞣花酸血浆样品而言，在酸性条件下采用外标法［3，10⁃12］处理时，血浆内源性物质不干扰测定，回收率均大于87.69%，而且操作简单，故本实验也选择该方法，与Mady 等［3］报道基本一致，可能是由于在酸性环境中更有利于鞣花酸进入乙腈而被有效提取出。

药动学结果显示，磷脂复合物可将鞣花酸口服吸收生物利用度提高至2.50 倍，可能与该剂型改变了后者存在状态、提高了其水溶性和脂溶性有关，但该成分易被胃肠道酶解［11］。文献［13］ 报道，磷脂复合物提高药物生物利用度还与灌胃液配制方式有关，并且其程度也可能存在差异。本实验所制备的鞣花酸磷脂复合物脂溶性得到极大改善，可为后续相关纳米制剂的开发奠定基础［14⁃17］。