一贯煎对急性肝窦阻塞综合征大鼠模型的干预作用及其部分效应机制

高思琦 肖准 王晓柠 刘伟 陈佳美 刘平

肝窦阻塞综合征(hepatic sinus obstruction syndrome，HSOS)，即肝小静脉闭塞性阻塞(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)，是由肝窦内皮细胞损伤导致的肝窦流出道梗阻的肝内门静脉高压综合征，可进展为多器官衰竭，其死亡率极高[1]。在中国，摄入含有天然毒性吡咯里西啶生物碱的土三七是导致HSOS的主要原因[2-4]。目前，临床尚无有效的治疗药物，现行可用的仅有去纤苷，在欧洲被批准用于治疗造血干细胞移植后的重症HSOS，但其治疗具有一定局限性[5]。现有研究表明，中药的一些活性成分具有改善HSOS的作用，如芝麻酚、川芎嗪等[6-7]，其主要作用机制可能与抗炎抗氧化相关。中医名方一贯煎出自清代医家魏之秀的《续名医类案》，由生地黄、麦冬、北沙参、枸杞、当归、川楝子六味中药组成，主治“胁痛，吞酸，吐酸，疝瘕，一切肝病”，有滋阴养肝之效。现代研究表明，一贯煎具有良好的抗肝纤维化作用，其主要作用机制与抗炎抗氧化，抗肝细胞损伤，改善肝窦毛细血管化以及抑制肝星状细胞活化有关[8-9]。然而一贯煎对于HSOS的干预作用尚未见报道。本研究探究中药复方一贯煎对野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的急性HSOS大鼠模型的干预作用，观察氧化应激、炎症及细胞凋亡相关指标并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司动物中心。动物许可证编号：XYXK(沪)2020-0009。饲养于上海中医药大学实验动物中心，自由饮食饮水，恒温恒湿，昼夜交替。动物实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准(PZSHUTCM190315007)。

1.2 药物、试剂和仪器

一贯煎由生地黄(18 g)、麦冬(10 g)、北沙参(10 g)、枸杞子(12 g)、当归(10 g)、川楝子(4.5 g)六味中药组成，浸膏粉(含生药3.021 g/g)由上海中医药大学附属曙光医院制剂中心(国家中医药管理局三级实验室)一次性制备。

野百合碱购自Sigma公司(C2401)；丙氨酸/天冬氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase/aspartate aminotransferase， ALT/AST)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione s-transferase，GST)活性检测以及苏木素—伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂盒购自基因科技(GK500705，批号：2018082901)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)购自碧云天(C1091，批号：031819190703)；逆转录试剂盒购自日本Toyobo公司；BCA蛋白质测定试剂盒购自Thermo 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自Proteintech公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

F200PRO型酶标仪(瑞士Tecan集团公司)；VIIA7型PCR仪(美国ABI公司)；041BR127719型电泳仪及转膜仪(美国Bio-Rad公司)；OdysseyCLX双色红外荧光成像系统(美国LI-CORBiosciences公司)； SCN400型数据切片扫描机(德国Leica公司)； QUANTA FEG 250环境扫描电子显微镜(荷兰飞利浦公司生产)。

1.3 动物模型制备与分组

将SD大鼠适应性饲养后根据体质量随机分为正常对照组、模型组及一贯煎组，每组8只，模型组及一贯煎组大鼠采用90 mg/kg MCT灌胃制备HSOS模型，正常对照组同时灌胃等量的蒸馏水。造模后6小时、30小时对一贯煎组大鼠予一贯煎(剂量为1.139g/kg)灌胃两次，模型组灌胃等量的蒸馏水，灌胃药液量为10 mL/kg。48小时后，各组均未见死亡，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死取材，采集血液(静置3小时后，转速1000 g/分钟，离心15分钟获取血清)和肝组织样本用于后续实验。

1.4 血清生化分析及组织病理学观察

将血清样本室温解冻，振荡混匀，按照试剂盒说明书步骤检测ALT和AST活性。肝组织病理学样品取肝脏大叶同一部位肝组织，置于10%中性甲醛缓冲液固定，自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，使用数据切片扫描机自动扫描，观察肝细胞损伤、炎症反应程度等。扫描电子显微镜观察样品制备：先用PBS通过大鼠腹主动脉灌注，后用含有2.5%戊二醛的固定液灌注、取样，样本处理后用QUANTA FEG 250环境扫描电子显微镜观察。

1.5 MDA含量、T-SOD及GST活性检测

在预冷的PBS中匀浆肝组织，采用MDA试剂盒测定。BCA法检测肝组织蛋白质浓度，MDA量表示为nmol/mg蛋白。肝脏T-SOD、GST活性检测同上，均根据试剂盒说明书测定。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测mRNA表达

称取肝组织，加入Trizol试剂对组织总RNA进行提取后，使用逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录，得到cDNA。用Real-time PCR检测肝组织mRNA的表达水平，采用2-ΔΔCt法计算各mRNA的表达量。

1.7 蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)检测肝组织蛋白表达

称取肝组织，加RIPA蛋白裂解液后，使用全自动研磨仪匀浆，提取上清液，BCA蛋白定量并加上样缓冲液。制备10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，膜封闭及抗体反应，使用odydssey红外图像系统检测，采用Image J软件分析各条带灰度值。

1.8 免疫组化染色

肝组织石蜡切片常规脱蜡复水，置于柠檬酸缓冲液(柠檬酸三钠3 g+柠檬酸0.4 g，定容至1000 mL)中，微波炉高温抗原修复，自然冷却至室温。将切片取出浸泡于3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，室温避光孵育10分钟，滴加10%山羊血清封闭30分钟，滴加一抗，4℃过夜。次日使用免疫组化试剂盒孵育二抗，37℃，30分钟，DAB显色，然后用苏木素染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.9 TUNEL法检测肝组织细胞凋亡

根据碧云天TUNEL试剂盒说明书操作。

1.10统计学分析

2 结果

2.1 一贯煎对MCT诱导的大鼠HSOS病理学变化及干预作用

模型组血清ALT及AST活性较正常对照组显著升高(P<0.01)，一贯煎组可显著降低MCT诱导的血清ALT、AST活性(P<0.05)。见表2。

表2 各组HSOS大鼠血清ALT、AST活性比较

肝组织HE染色可见正常组肝脏组织结构正常，肝板排列整齐，汇管区未见扩大及炎症细胞浸润。而模型组则见肝脏结构破坏严重，肝细胞大面积坏死，汇管区周围炎性细胞浸润，肝窦内红细胞大量聚集，“瘀血”现象明显，一贯煎组肝组织损伤明显减轻。见图1。

图1 各组HSOS大鼠肝组织HE染色结果(×200)

肝组织扫描电镜结果可见，与正常对照组相比，模型组肝窦内皮呈现连续性破坏，肝窦内皮窗孔扩大，“筛状”结构消失，甚至脱落，使Disse空间暴露；而一贯煎组的肝窦内皮损伤病变明显改善，表明一贯煎可显著改善MCT诱导的HSOS大鼠的肝窦内皮细胞损伤、肝细胞坏死等病理改变。见图2。

图2 各组HSOS大鼠肝组织扫描电镜结果(×20，000)

2.2 一贯煎对MCT诱导的HSOS大鼠肝脏氧化应激及炎性因子的影响

与正常对照组相比，模型组肝组织GST活性和MDA含量显著升高(P<0.05)，一贯煎组肝组织GST活性较模型组有所降低，MDA较模型组显著降低(P<0.05)。模型组T-SOD活性较正常对照组显著降低(P<0.01)；与模型组相比，一贯煎组肝组织T-SOD有升高的趋势。见表3。

表3 各组HSOS大鼠肝组织GST活性、T-SOD活性和MDA含量比较

与正常对照组相比，模型组肝组织炎症相关因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、血红加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)及炎症小体(nod-like receptor protein 3，NLRP3)的mRNA表达显著增加(P<0.01)，而一贯煎干预组肝组织中这些基因的表达较模型组显著降低(IL-1β：P<0.05，HO-1：P<0.01)。见表4。

表4 各组HSOS大鼠肝组织TNF-α、IL-1β、HO-1及NLRP3的mRNA表达比较

与正常对照组相比，模型组肝组织TNF-α蛋白表达显著升高(P<0.01)，而一贯煎组肝组织TNF-α的蛋白表达较模型组显著降低(P<0.01)。见图3、表5。此外，肝组织巨噬细胞标志物F4/80免疫组化染色结果显示，与正常组相比，模型组F4/80的阳性面积显著增加，一贯煎干预后F4/80的阳性面积明显减少(见图4)。以上结果提示一贯煎可改善MCT诱导的HSOS大鼠肝脏氧化应激及炎症反应。

图3 各组HSOS大鼠肝组织TNF-α蛋白表达

表5 各组HSOS大鼠肝组织TNF-α蛋白表达比较

图4 各组HSOS大鼠肝组织F4/80蛋白表达(×200)

2.3 一贯煎对MCT诱导的HSOS大鼠肝细胞凋亡的影响

肝组织经TUNEL染色可见，正常组肝组织几乎没有TUNEL阳性表达；模型组肝组织TUNEL主要表达在肝细胞上，TUNEL阳性细胞显著增多；一贯煎组肝组织TUNEL阳性细胞数较模型组明显减少(见图5)。进一步检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)的表达发现，模型组肝组织Bcl2的蛋白表达及Bcl2/Bax的比值较正常组显著降低(P<0.01，P<0.05)，而一贯煎组干预后均有所提高(见图6、表6)，提示一贯煎可显著减轻MCT诱导的HSOS大鼠肝细胞凋亡。

图5 各组HSOS大鼠肝组织凋亡TUNEL染色(×200)

图6 各组HSOS大鼠肝组织Bcl2/Bax蛋白表达

表6 各组HSOS大鼠肝组织Bcl2/Bax蛋白表达比较

3 讨论

HSOS作为一种肝病的危重症，常因肝肿大、腹水、黄疸、门静脉高压甚至严重的肝衰竭而导致死亡，其在临床上目前尚无可用的治疗药物。现行可用的去纤苷，临床报道数据显示，治疗HSOS的治愈率仅25.5%[10]。除去纤苷外，一些单克隆抗体、索拉菲尼等也具有治疗HSOS的作用，但仍处于实验室研究阶段[11-14]。国内提出的“吡咯生物碱相关肝窦阻塞综合征诊断和治疗专家共识意见(2017年, 南京)”[15]对该病的治疗也仅限于对症支持疗法，因而探求HSOS的有效治疗药物具有十分重要的临床意义。天然产物MCT属于PAs，其代谢产物脱氢野百合碱可通过与肝窦内皮细胞上的F-actin共价结合，导致F-actin解聚，并进一步造成肝窦充血以及微循环障碍，引起广泛的炎症和组织坏死，最终形成HSOS。MCT诱导的HSOS模型具有典型的HSOS病理学特点，被广泛用于HSOS的研究[16-18]。

HSOS疾病发生的关键环节在于肝窦内皮细胞损伤，电镜下可见MCT造成的肝血窦扩张，内皮窗孔扩大，“筛状”结构消失，甚至脱落而致窦内皮的不连续，以及Disse空间暴露等一系列肝窦内皮细胞严重损伤的表现，而一贯煎可显著减轻肝窦内皮细胞的损伤。且一贯煎显著降低MCT诱导的大鼠血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性，显著改善MCT大鼠肝组织病理改变。此外，TUNEL检测结果还显示一贯煎可显著抑制HSOS大鼠肝组织的肝细胞凋亡。

强烈的氧化应激与HSOS的发生发展密切相关。MDA作为脂质过氧化的终产物，可影响线粒体链复合物及相关酶活性，加剧细胞损伤，是公认的有效评估组织氧化应激反应的标志物[19]。本研究中，MCT处理后造成肝脏内MDA的大量蓄积是强烈氧化应激的反映，而在予以一贯煎干预后则显著下降。已有研究表明，中药中的一些活性单体如黄芩素、绿原酸、儿茶素、甘草素与甘草苷均可通过调控相关代谢酶，提高机体抗氧化能力以发挥对MCT诱导的HSOS的改善作用[18, 20-21]。其中，GST可促进GSH与有亲电子物质的结合，并清除体内脂质过氧化物。本研究中，MCT处理后造成肝脏急性损伤导致GST活性应激性的升高，而一贯煎干预后其活性降低。T-SOD的结果也提示一贯煎减弱了MCT诱导的大鼠肝脏氧化应激损伤。即结果均表明可能是通过减轻肝脏氧化应激损伤而改善MCT诱导的HSOS。

炎症反应是HSOS发生发展中起关键作用的环节，其中TNF-α作为重要促炎因子[22]，可响应氧化应激而被激活，可作为平衡细胞存活、凋亡和坏死中的主要调节剂，是联系氧化应激反应与细胞死亡的重要环节。在本实验中，MCT处理后肝组织TNF-α的mRNA和蛋白表达显著增加，这与HSOS发生的严重的炎症风暴及细胞死亡相一致。同时，在肝脏急性损伤后，巨噬细胞的浸润一方面可介导炎症的发生，另一方面对肝脏的血管及肝窦内皮细胞的修复具有十分重要的作用[23-24]。肝组织免疫组化染色显示MCT造模后巨噬细胞标志物F4/80在损伤区域的大量阳性表达，提示肝组织发生了严重的炎症反应。同时，MCT引起的氧化应激使得炎症小体NLRP3和促炎因子IL-1β的mRNA表达显著增加，而一贯煎干预后TNF-α、F4/80及IL-1β的表达显著下降，表明一贯煎具有良好的抗炎作用。然而本实验MCT处理后HO-1的mRNA表达显著增加，而一贯煎干预后HO-1的mRNA表达显著下降，该结果似乎与既往研究[25-26]不同。考虑导致差异的主要原因可能是由于体内实验的复杂性，并且全身的反应不仅限于肝脏。MCT导致HO-1的mRNA表达的增加可能是由于强烈的氧化应激反应而诱发机体的自我防御能力，而一贯煎可显著改善HSOS的病理变化，炎症反应也显著减轻，因此HO-1的mRNA表达随之降低。

此外，细胞死亡也是HSOS的重要表现之一[1]，其中由强烈的氧化应激引起的凋亡途径是其中重要的环节。Bcl2家族蛋白在该途径中发挥着重要的作用，包括抗凋亡蛋白Bcl2及促凋亡蛋白Bax[27]。MCT诱导的大鼠HSOS肝组织中可见严重的大面积的细胞死亡，而一贯煎干预后肝组织HE染色及TUNEL染色显示出细胞凋亡明显减轻，且Bcl2的表达和Bcl2/Bax升高，提示一贯煎可能是通过提高抗凋亡蛋白Bcl2的表达抑制肝细胞的凋亡进而改善HSOS。

综上，一贯煎可显著改善野百合碱诱导的大鼠HSOS，其作用机制可能与抗过氧化抗炎性损伤，抑制肝细胞凋亡有关。本研究为中医古籍方剂一贯煎治疗HSOS的临床应用发展提供部分实验基础。

致谢 特别感谢上海中医药大学科技实验中心陆雄、陆敏两位老师对课题组的电镜技术及病理解读方面提供的帮助与支持！