丁酸型产氢细菌WN9利用谷糠发酵的产氢特征

王霜傲，张 震，叶思岑，刘 茹，杨 静，赵 鑫，2

（1.东北大学 资源与土木工程学院，辽宁 沈阳 110819；2.东北大学 智慧水利与资源环境科技创新中心，辽 宁 沈 阳 110819）

0 引言

氢气，因其独特的环境友好性和优秀的能量携带能力（1.42×105J/g），被广大科研和商业机构认为是亟待大力开发和推广的新型能源[1]。除了传统的物理和化学方法外，还可以采用微生物发酵的方式来制取氢气，即生物制氢技术。生物制氢技术具有制氢过程温和稳定、能耗低、可以利用很多廉价的有机废弃物、可实现有机废水和废弃物的质能转化等优点。虽然生物制氢技术具有很多优点，但是，在生物制氢技术工程化的道路上仍存在着菌种的氢转化效率有待提升、底物选择范围有待拓宽和转化效率有待增强等问题。

针对产氢菌氢转化效率有待提升的问题，研究人员开展了高效产氢菌株的筛选以及工程菌株的构建等研究，并取得一些进展。目前，已分离获得的高效产氢菌株主要来自Clostridium，Enterobacter和Ethanoligenens等 菌 属[2]。其 中，关于Clostridium菌属的研究最多，Clostridium菌属的产氢菌株的产氢效率也相对更高[3]，[4]。张月超分离了1株具有异化铁还原能力的产氢菌C.bifermentans EZ-1，以葡萄糖为底物时，最大比产氢率（以单位摩尔质量的葡萄糖计）为1.11 mol/mol[5]。Noparat P从油棕汁液中分离了可以利用多种碳源发酵产氢的C.beijerinckii PS-3，其最大比产氢率（以单位质量的总糖计）为140.9 mL/g[6]。Zhang J N从牛粪堆中分离了可以高效转化纤维素的产氢细菌C.sartagoforme FZ11，以10 g/L微晶纤维素和羧甲基纤维素钠为底物时，最大比产氢率（以单位 质 量 的TS计）分 别 为77.2，64.6 mL/g[7]。

在我国，小米主要种植在黄河以北，年产量巨大，随之产生的谷糠（分为外壳谷糠和内壳谷糠，其中，外壳谷糠是谷子粗加工时的副产物，内壳谷糠是谷子加工成小米时的副产物）处置问题也亟待进一步解决[8]。如果能够使用发酵产氢微生物，进一步利用谷糠中的纤维素和剩余淀粉，将其转化为可被利用的氢气，将为谷糠处置和资源化提供新的思路。

本研究尝试从富含有机沉淀物的河道底泥中分离获得高效产氢菌株，并对产氢效率最高的菌株进行生理生化和系统发育鉴定，确定其系统发育地位；在初步了解产氢菌株比产氢率等特性的基础上，进一步探讨其以谷糠为底物时的产氢特征，从而为后续开展谷糠类底物的发酵产氢研究提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 产氢菌的富集与分离筛选

PYG培 养 基（g/L）:葡 萄 糖10，蛋 白 胨3，酵 母浸 粉1，Na2HPO4·12H2O 21.5，KH2PO4·2H2O 8.1，MgCl2·6H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.1，L-cysteine 0.3。

培养基定容后加热至100℃，使用注射器转移至厌氧管中，高纯氮气吹脱残留溶解氧，橡胶塞封口，121℃灭菌15 min备用。

产氢菌富集物为牡丹江江滨公园富含有机沉淀物的河道底泥。称取1 g底泥样品装入4 mL灭菌离心管，加入3 mL无菌生理盐水，涡旋振荡1 min，再静止1 min，使用无菌注射器取0.5 mL上清液，转接入厌氧的PYG培养基中。在恒温摇床中于35℃培养48 h，富集产物经3代转接，对生物气进行色谱检测，对氢气产量最高的富集样本使用Hungate滚管技术进行厌氧细菌分离。挑取单菌落转至新的PYG液体培养基，继续培养，并持续检测气体含量，将产气能力好的富集菌利用Hungate滚管技术纯化至纯培养细菌。

1.2 生理生化与系统生物学鉴定

利用Olympus BX51型光学显微镜和Hitachi 7500型透射电子显微镜观察所筛选菌株的形态学特征[9]。革兰氏染色观察使用标准方法操作。使用北京索莱宝公司的小量细菌基因组提取试剂盒抽提基因组DNA，16S rRNA基因全长使用通用引物BSF 8/27和BSR 1525/1541扩增，PCR扩增条件参照文献[9]。PCR扩增产物送华大基因公司进行测序分析。测序结果与GenBank数据库的细菌信息进行比对分析。使用MEGA 6.0构建系统发育树。

1.3 细菌产氢能力研究

通过在100 mL的厌氧瓶中进行批次实验来研究细菌的产氢能力，分装50 mL工作体积的PYG培养基，其余操作与富集培养时一致。按5%的体积比接种对数期的产氢菌，35℃恒温气浴震荡培养，24 h后使用排水法测定生物气体积。葡萄糖含量通过上海荣盛公司的葡萄糖测定试剂盒检测。生物量以细菌烘干恒重的细胞干重计算[10]。实验中，发酵生物气组分和挥发酸含量使用气相色谱Agilent 7890A进行测定，色谱柱为GSGASPRO和DB-FFAP[11]。

1.4 以谷糠为底物时的产氢特征研究

谷糠取自辽宁省朝阳县。内/外壳谷糠分别自然风干后粉粹，经40目分样筛过筛后备用。为了确定产氢菌以内、外壳谷糠作为唯一碳源时的产氢能力，将谷糠投加量设定为0～70 g/L；同时，探讨初始pH为4.0～9.0时，产氢菌利用谷糠产氢的能力。使用质量分数为10%的HCl或NaOH溶液调节培养基的pH值（使用S220型pH计测定）。批次实验在100 mL的厌氧瓶中完成，分装50 mL使用谷糠替代葡萄糖的PYG液体培养基，其余操作与之前相同。按5%的体积比接种对数期的产氢菌，35℃恒温气浴震荡培养，48 h后使用排水法测定生物气体积。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离与生长特征

经过初步富集与分离，共获得9株具有较好产氢能力的菌株，其产氢能力如表1所示。其中，编号为WN9的菌株产氢能力最高，在富集培养基中，比产氢率（以单位摩尔质量的葡萄糖计）可达 到1.69 mol/mol。

表1 初步分离菌株的产氢能力比较Table 1 H2 production capacity of different strains

菌株WN9严格厌氧，在PYG液体培养基中培养24～48 h后呈乳白色，浑浊但无凝结沉淀。在固体培养基表面可形成直径为2～3 mm的乳白色不透明菌落，有明显边缘，表面光滑，略粘稠。光学显微镜观察发现，菌株WN9呈短杆状，可运动，革兰氏阳性，可产芽孢。图1为菌株WN9的透射电子显微镜照片。从图1可以看出，菌株WN9周身有 多 根 鞭 毛，菌 体 大 小 为0.5～1.0μm×2.0～2.5μm。

图1 菌株WN9的透射电镜显微照片Fig.1 TEM micrograph of strain WN9

2.2 菌株的系统发育特征

菌株WN9的16S rRNA基因序列大小为1 455 bp。与GenBank数据库已有的模式菌序列的比对结果显示，菌株WN9与丁酸梭菌模式菌株C.butyricum JCM 1391T（NR1132441）的 相 似 性 最高，为99.9%。结合生理生化特征，确定菌株WN9为丁酸梭菌属的新菌株，命名为C.butyricum WN9。

2.3 菌株WN9以葡萄糖为底物时的产氢特征

在进一步探讨菌株WN9利用其他底物产氢的能力之前，先在35℃的恒温条件下，对其以10 g/L葡萄糖为底物的发酵产氢能力进行了研究。经过24 h的培养，菌株WN9对葡萄糖的利用率为91.7%，细胞干重为1.04 g/L，终点pH值为4.10，比产氢率（以单位摩尔质量的葡萄糖计）为1.89 mol/mol，较原始培养提升了11.8%；菌株WN9的气相末端产物为H2和CO2（体积分数分别约为52.9%和47.1%），液相末端产物为丁酸（约 为2 300 mg/L）、乙 酸（约 为2 200 mg/L）、乙 醇（约为13 mg/L）和丙酸（约为11 mg/L）。实验结果表明，连续转代和对数期接种可以进一步提升菌株的生长活性，提升其代谢效率，有助于提高产氢菌的底物转化利用能力，提高系统的产氢效率。

2.4 菌株WN9以谷糠为底物时的产氢特征

谷糠中含有较多的纤维素和少量的淀粉，可供微生物生长使用。为了探讨菌株WN9以其为底物进行发酵产氢的可能性，分别研究了谷糠浓度和初始pH对菌株WN9产氢效率的影响。

2.4.1 谷糠浓度对菌株WN9产氢的影响

为探寻最适的谷糠使用量，在温度为35℃，初始pH值为7.0的条件下，选择内、外壳谷糠的投加量（底物浓度）均为0～70 g/L，然后进行发酵产氢实验，实验结果如图2所示。

图2 底物浓度对比产氢率的影响Fig.2 Effects of substrate concentration on H2 production yield

从图2可以看出，以内、外壳谷糠为底物时，随着底物浓度的逐渐增大，比产氢率（以单位质量的TS计，下同）均表现出先增加后降低的变化趋势，但最大比产氢率并不同时获得。以外壳谷糠为底物时，比产氢率随着底物浓度的增加而增长，并在底物浓度为30 g/L时获得最大值 （12.7 mL/g），随后，随着底物浓度的继续增加，比产氢率则逐步降低。以内壳谷糠为底物时，获得的比产氢率明显高于外壳谷糠。当底物浓度为10 g/L时，比产氢率为15.0 mL/g；随着底物浓度的逐渐增加，比产氢率也逐渐增加，并在底物浓度为50 g/L时获得最大值（20.1 mL/g）；随着底物浓度的继续增加，比产氢率随之下降。以内壳谷糠为底物时获得的最高比产氢率是以外壳谷糠为底物时的1.58倍。

底物浓度对产氢系统终点pH值（简称为终点pH值）的影响如图3所示。从图3可以看出，随着底物浓度的逐渐增加，以内、外壳谷糠为底物时的终点pH值均表现出下降的趋势，且以内壳谷糠为底物时的终点pH值的下降趋势更加明显。以外壳谷糠为底物时，随着底物浓度的逐渐增加，终点pH值缓慢降低，从pH 6.55（底物浓度为10 g/L）缓慢降低至pH 5.97（底物浓度为70 g/L）；而相同条件下，以内壳谷糠为底物时，终点pH值快速地从pH 6.43降低至pH 5.14。

图3 底物浓度对终点pH值的影响Fig.3 Effects of substrate concentration on endpoint pH

小米谷糠中含有较多硬壳 （纤维素和半纤维素含量很高），这些硬壳很难被细菌直接利用。特别是外壳谷糠，可被利用的有机物更少，而内壳谷糠中除含有纤维素和半纤维素外，还含有少量的淀粉和多糖。因此，以外壳谷糠为底物时，菌株WN9的发酵产氢效率明显低于以内壳谷糠为底物时。当外壳谷糠浓度增加至30 g/L时，比产氢率获得最大值。虽然，随着外壳谷糠浓度继续增加，有机物浓度增加，但是，可被利用的底物有限，由于底物的限制，总体的比产氢率明显降低。内壳谷糠的硬壳含量较低，含有更多的可被利用的淀粉和多糖，因此，以内壳谷糠为底物时，菌株WN9的产氢量明显优于外壳谷糠。当底物浓度高于20 g/L，比产氢率的变化不明显，仅在底物浓度为50 g/L时获得最大值，随后，又略有下降。比产氢率变化不大，说明绝大多数底物中的可利用有机质都被用于细菌的生长和产氢，这与挥发酸产量增加，终点pH值始终保持匀速下降的趋势相吻合。

2.4.2 初始pH值对谷糠发酵产氢的影响

产氢系统的初始pH值（简称为初始pH值）是影响发酵产氢的重要因素之一。为了探寻菌株WN9以谷糠为底物发酵产氢的最佳初始pH值，在温度为35℃，内、外壳谷糠浓度均为50 g/L的条件下，选择初始pH值为4.0～9.0进行了对比实验研究，实验结果如图4所示。

图4 初始pH值对比产氢率的影响Fig.4 Effects of initial pH on H2 production yield

从图4可以看出，分别以内、外壳谷糠为底物时，随着初始pH值的逐渐升高，比产氢率均表现出先增高后降低的变化趋势。以外壳谷糠为底物时，比产氢率随初始pH值的逐渐升高而缓慢增加，并在初始pH值为6.0时获得最大值（15.5 mL/g）；当初始pH值继续升高时，比产氢率迅速降低，并明显低于初始pH值为4.0时的比产氢率。以内壳谷糠为底物时，比产氢率随初始pH值的逐渐升高而明显增长，并在初始pH值为6.0时获得最大值（21.5 mL/g）；当初始pH值继续增加至7.0时，比产氢率缓慢降低，之后随初始pH值的升高而迅速下降。

初始pH值对终点pH值的影响如图5所示。从图5可以看出，分别以内、外壳谷糠为底物时，终点pH值均随着初始pH值的升高而升高。但是，以外壳谷糠为底物时的终点pH值始终略高于以内壳谷糠为底物时，特别是在初始pH值为6.0～7.0时，终点pH值的差别更明显。这说明以内壳谷糠为底物更适宜产氢菌生长，从而产生更多的挥发酸，降低了体系的终点pH值。

图5 初始pH值对终点pH值的影响Fig.5 Effects of initial pH on the endpoint pH

有研究表明，过低或过高的初始pH值均会降低微生物的活性，或直接抑制细菌的生长，从而导致产氢效率受到影响[13]。但是，与其他研究明显不同的是，在本研究中，当初始pH值为4.0～6.0时，菌株WN9可以获得比初始pH值为7.0～9.0时更高的比产氢率，特别是以外壳谷糠为底物时。因此，可以推断，较低的初始pH值可以帮助破坏谷糠硬壳部分的纤维素和半纤维素结构，有利于释放其中的有机质，从而更好地被产氢菌株利用，菌株自身代谢产生的有机酸，进一步加快了这一过程，提高了底物的转化效率。当体系的初始pH值＞7.0时，对底物没有酸解作用，其中的有机质很难被释放并利用，因此，比产氢率明显较低。由于外壳谷糠中的硬壳部分比内壳谷糠多，因此，这一现象更加明显。

3 结论

本研究从牡丹江河道底泥中分离了1株丁酸型发酵产氢细菌C.butyricum WN9，该细菌以葡萄糖为底物进行发酵时，液相末端产物为乙酸、丁酸、乙醇和丙酸，气相末端产物为H2和CO2，比产氢率为1.89 mol/mol。以小米内、外壳谷糠为唯一碳源时，最适宜的底物浓度分别为50，30 g/L，且内壳谷糠更易被产氢菌利用，最大比产氢率为20.1 mL/g。低pH条件（pH＜6）有利于酸解外壳谷糠，释放其中的有机质，提高产氢效率。以内、外壳谷糠为底物时，最适初始pH值均为6.0，最大比产氢率分别为21.5，15.5 mL/g。